經(jīng)高密度納米坑制備生物大分子單分子芯片的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物芯片制作技術(shù)，具體是一種生物大分子(即DNA、RNA和蛋白質(zhì))高密度單分子芯片的制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高密度生物大分子(DNA、RNA和蛋白質(zhì))單分子芯片，即每一個(gè)樣點(diǎn)只有一個(gè)生物大分子，樣點(diǎn)間距達(dá)到光學(xué)分辨率極限，可以實(shí)現(xiàn)單位面積的數(shù)據(jù)量最大化；各樣點(diǎn)上的單分子，可通過(guò)分子生物學(xué)手段修飾后用作“誘餌”，捕獲靶分子，既可用于分子間如抗原與抗體間的相互作用、DNA雜交檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)變異和比較基因組雜交芯片等，也可用于DNA合成法測(cè)序、連接法測(cè)序等，將第二代測(cè)序技術(shù)轉(zhuǎn)換為第三代測(cè)序技術(shù)。但是，生物大分子單分子芯片的制作難度大，傳統(tǒng)的方法采用稀釋的生物大分子溶液鋪設(shè)，有很大的隨機(jī)性，有許多分子因相互重疊而無(wú)法觀察；此外，基片上部分區(qū)域樣點(diǎn)極少或沒(méi)有樣品，檢測(cè)效率降低。迄今，還沒(méi)有比較有效的高密度生物大分子單分子芯片制作技術(shù)。
[0003]經(jīng)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，2010年，Complete Genomics (華大基因)公司在SCIENCE(第327卷，第78-81 頁(yè))發(fā)表了題為“Human Genome Sequencing Using UnchainedBase Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays”論文。該項(xiàng)技術(shù)將經(jīng)滾環(huán)復(fù)制后形成的DNA納米球樣品固定到預(yù)先制備好的硅基陣列中，大大增加了芯片表面檢測(cè)樣點(diǎn)的密度，有效地提高了 DNA測(cè)序通量和試劑的使用效率。但是，滾環(huán)復(fù)制后進(jìn)入陣列的DNA并非來(lái)自天然基因組的單拷貝片段，而是短片段的多重拷貝，也即該芯片不是真正意義上的單分子DNA芯片。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是指提供單分子狀態(tài)的高通量生物芯片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的單分子芯片制作技術(shù)，即經(jīng)高密度納米坑制備生物大分子單分子芯片，該方法可將單個(gè)生物大分子固定于納米陣列，通過(guò)單分子樣點(diǎn)的間距控制，建立高密度、多功能生物大分子的單分子芯片。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:制備能扦插入單個(gè)生物大分子的納米坑陣列；并對(duì)納米坑陣列底部進(jìn)行選擇性表面修飾而活化，以確保單個(gè)生物大分子能夠固定到納米坑陣列中；因基片表面的其他區(qū)域未被活化，不能綁定目標(biāo)分子；最后清洗基片，獲得高通量的單分子生物芯片。
[0006]所述方法具體按照如下步驟實(shí)施:
[0007]第一步，納米陣列基底的制備:在潔凈的基底上鍍一層薄膜，薄膜的化學(xué)成分與基底不同，以備后續(xù)選擇性修飾基底。
[0008]第二步，納米坑陣列的制備:刻蝕薄膜，直至基底暴露，制作出直徑小于2個(gè)生物大分子的納米坑；如此反復(fù)，制作出納米坑陣列；
[0009]第三步，納米坑底部的選擇性修飾:用化學(xué)方法，選擇性修飾納米坑底部，使之?dāng)y帶上活性基團(tuán)A ;因薄膜材料化學(xué)成分與基底不同，不能被修飾，因此，經(jīng)清洗后，薄膜表面不含活性基團(tuán)A ;此后，直接進(jìn)入下一步。
[0010]第四步，單分子生物芯片的制備:將攜帶可以與活性基團(tuán)A發(fā)生連接反應(yīng)的活性基團(tuán)B的生物大分子，在連接溶液中與基底發(fā)生連接反應(yīng)；因?yàn)榧{米坑的直徑小于2個(gè)生物大分子，因此，內(nèi)部只能連接I個(gè)生物大分子，反應(yīng)完成后經(jīng)清洗，獲得高密度生物大分子單分子芯片。
[0011]優(yōu)選地，所述的基底，可以采用常用的基底材料，包括但不限于石英，玻璃片，硅片，云母片等。
[0012]優(yōu)選地，所述的薄膜，可以是金或鉬等金屬材料，也可以是PMMA等非金屬材料。在選用有熒光淬滅效應(yīng)的材料做薄膜時(shí)，上述第四步之后需要在薄膜上覆蓋厚度多5nm的保護(hù)層，屏蔽淬滅效應(yīng)。
[0013]優(yōu)選地，所述的在基底上鍍一層薄膜，可以采用離子濺射、磁控濺射或者旋涂光刻膠等方法，薄膜厚度不大于生物大分子的直徑。
[0014]優(yōu)選地，所述的刻蝕薄膜，可以用聚焦離子束(FIB)或聚焦電子束(FEB)輻照刻蝕薄膜。所述的刻蝕，是指控制基底暴露的加工技術(shù)，可以是FIB或FEB。
[0015]優(yōu)選地，根據(jù)需要，納米坑中心間距控制在< 1000納米。所述的納米坑中心間距(1000納米，是根據(jù)所采用的熒光分子的波長(zhǎng)而定，兩個(gè)相鄰的熒光分子有分辨率極限，當(dāng)前的高分辨率光學(xué)顯微鏡的分辨極限為200納米，隨著科學(xué)技術(shù)進(jìn)步，有了突破當(dāng)前分辨極限的顯微鏡，本發(fā)明的納米孔中心間距，還可以隨之降低；本發(fā)明也可以制備納米坑中心間距超過(guò)1000納米的陣列，但芯片上的樣點(diǎn)量將大幅度下降，檢測(cè)的信息量也會(huì)隨之降低。
[0016]優(yōu)選地，所述的生物大分子，可以是蛋白質(zhì)的單體、二聚體和多聚體(包括抗體)，也可以是單個(gè)蛋白質(zhì)攜帶單根核酸分子的復(fù)合物；所述核酸分子，可以是DNA，也可以是RNA0
[0017]優(yōu)選地，所述的活性基團(tuán)A與B，是指二者能夠發(fā)生免疫綁定、直接或介導(dǎo)形成共價(jià)鍵的活性基團(tuán)對(duì)，凡是能夠?qū)崿F(xiàn)該目的的活性基團(tuán)對(duì)均可，包括但不限于:生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗體、氨基-環(huán)氧基、氨基-羧基(包括羧基的活化形式如琥珀酰亞胺碳酸酯等)、氨基-羰基、巰基-馬來(lái)酰亞胺、巰基-環(huán)氧基、巰基-巰基、巰基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0019]與國(guó)內(nèi)外同類芯片相比，本發(fā)明采用的制備工藝簡(jiǎn)單，適于大規(guī)模的單分子芯片制備，單分子樣點(diǎn)間距可控，單分子連接效率接近100%?？捎糜诔`敏單分子酶聯(lián)免疫吸附分析、基于雜交的DNA變異檢測(cè)、單分子DNA合成和連接測(cè)序以及單細(xì)胞RNA測(cè)序等。
【附圖說(shuō)明】
[0020]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0021]圖1為規(guī)則納米點(diǎn)陣列的制備流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。全部實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例及附圖所采用的方法。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造商所建議的條件進(jìn)行。
[0023]以下實(shí)施例中，對(duì)于制備得到的生物大分子單分子芯片的檢測(cè):用熒光分子標(biāo)記生物大分子，清洗后，在高分辨熒光顯微鏡下檢測(cè)。
[0024]所述的用焚光分子標(biāo)記生物大分子后檢測(cè)，也可以在固定生物大分子前，用焚光分子標(biāo)記生物大分子后檢測(cè)。
[0025]所述的單分子芯片的質(zhì)量檢測(cè)，可以采用熒光標(biāo)記的方法在熒光顯微鏡下檢測(cè)。也可以采用非熒光檢測(cè)方法，如原子力顯微鏡檢測(cè)。
[0026]實(shí)施例1
[0027]第一步，采用離子濺射，在現(xiàn)剝離的云母基片表面鍍1nm厚的鉑金薄膜。
[0028]第二步，采用FIB在鍍膜基片上刻蝕出直徑約30nm的納米坑，使納米坑底部暴露出云母表面，再在與該納米坑相距500nm處重復(fù)該刻蝕過(guò)程，如此循環(huán)反復(fù)而制備出納米坑陣列。
[0029]第三步，用乙醇和丙酮清洗納米坑陣列，干燥后置于APTES (氨丙基三乙氧基硅烷)溶液處理，選擇性使陣列中納米坑的底部氨基化，清洗后用B1tin-NHS (生物素-N-琥珀酰亞胺基酯)處理，使坑底表面選擇性生物素化。
[0030]第四步，用數(shù)量多于納米坑數(shù)的單個(gè)四聚體狀態(tài)的抗鏈酶生物素蛋白攜帶單個(gè)生物素標(biāo)記的單根DNA分子復(fù)合物溶液處理納米坑陣列，使復(fù)合物中抗鏈霉生物素上的自由活性綁定位點(diǎn)與納米坑底部的生物素綁定。由于納米坑底部只能容納一個(gè)抗鏈霉生物素分子，又有足