400至700個正方形單元的網(wǎng)格是最優(yōu)選的。
[0039] 單元覆蓋樣品的整個表面。
[0040] 目標(biāo)細(xì)胞密度可W表示為每單位組織樣品的表面積（例如每皿2)計(jì)數(shù)的所述目 標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量。目標(biāo)細(xì)胞的密度也可W由每總細(xì)胞或總細(xì)胞亞群（設(shè)定為100% )的特定 細(xì)胞亞群（例如，CD3+T細(xì)胞）的百分比組成。在該方法的步驟g)，對于每種使用的生物標(biāo) 志物獲得多于一個定量值允許相比于每種生物標(biāo)志物僅測定一個定量值時更精確的治療 響應(yīng)的最終癌癥預(yù)后或預(yù)測。
[0041] 當(dāng)用于評價(jià)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量或密度的方法隨后為其中染色質(zhì)量可能 是所獲得結(jié)果的準(zhǔn)確性的重要參數(shù)的進(jìn)一步步驟時，檢查組織切片的染色質(zhì)量是重要的。
[0042] 因此，在實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選條件下，所述方法進(jìn)一步包括檢查組織切片的染色質(zhì) 量的步驟el。
[0043] 檢查染色質(zhì)量可W通過，優(yōu)選用適當(dāng)軟件，計(jì)算對于每個單元與總腫瘤區(qū)域檢測 到的陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度的分布（代表所述分布）來實(shí)施。
[0044] 可W針對每個分析的載片計(jì)算和提供腫瘤區(qū)域中檢測到的所有陽性染色細(xì)胞的 相關(guān)（例如蹤色）染色強(qiáng)度的平均值、中值、最小值和最大值。
[0045] 染色強(qiáng)度的值和分布可W與針對每種標(biāo)記物測定的參考值（正常范圍強(qiáng)度）進(jìn)行 比較。
[0046] 在檢測步驟f.中，計(jì)數(shù)每個單元的陽性細(xì)胞的數(shù)量。由于每個單元的表面是已知 的，所W每個表面單元的陽性細(xì)胞的密度也是已知的。步驟f.可W由技術(shù)人員、通常由醫(yī) 生人工進(jìn)行，或者可W通過適當(dāng)?shù)能浖韺?shí)施。該方法允許定量來自患者的腫瘤組織樣品 中至少一種指示所述患者針對癌癥的免疫響應(yīng)的狀態(tài)的生物標(biāo)志物。
[0047] 上述方法可用于根據(jù)患者的預(yù)期存活率或他們對于癌癥治療的響應(yīng)將患者分組。 對于使用的每種生物標(biāo)志物，可W將上述值與對于相同生物標(biāo)志物的預(yù)定參考值進(jìn)行比 較；所述預(yù)定參考值與所述患者的所述癌癥進(jìn)展和/或存活率的特定預(yù)后和/或?qū)Π┌Y治 療的響應(yīng)（"良好響應(yīng)者"VS "差響應(yīng)者"）相關(guān)。
[0048] 對于給定標(biāo)志物，W下參數(shù)可用于定量每個單元的染色細(xì)胞：
[0049] -染色細(xì)胞的總數(shù)量
[0050] -每個表面單元的染色細(xì)胞的密度
[0051] -分離的染色細(xì)胞（不與其它染色細(xì)胞接觸）的總數(shù)量
[0052] -染色細(xì)胞簇內(nèi)染色細(xì)胞的總數(shù)量（其中，至少1個染色細(xì)胞與最少3個染色細(xì)胞 接觸）。
[0053] 在用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選條件下，
[0054] -分析腫瘤的每個區(qū)域燈和IM)。
[00巧]-測定每個單元的染色細(xì)胞的密度。
[0056] -根據(jù)檢測的染色細(xì)胞的密度并根據(jù)等級，例如綠色至紅色（從最小密度至最大 密度），將顏色分配給每個單元。該些步驟優(yōu)選通過適當(dāng)?shù)能浖韺?shí)施。
[0057] 優(yōu)選地，每個腫瘤區(qū)域（CT和IM)中染色細(xì)胞的密度通過1至1000個單元，優(yōu)選2 至100個單元，更優(yōu)選3至10個單元，最優(yōu)選3個單元（具有最大密度）的平均密度來測 定。具有最大密度的單元的選擇優(yōu)選通過適當(dāng)?shù)能浖韺?shí)施。對于CT和IM區(qū)域中的每一 個，獲得一個值。如果所述值高于闊值，則樣品被認(rèn)為是陽性的。因此，對于單一標(biāo)志物，四 種可能性是可能的；CT+和IM+，CT-和IM-，CT+和IM-，CT-和IM+。當(dāng)使用CD3、CD8、CD20、 CD45R0和GZMB標(biāo)志物中的兩個或更多個時，對于第二標(biāo)志物，相同可能性是可能的。
[0058] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果30 %或更多，優(yōu)選40 %或更多的考慮的單元表面填充有 細(xì)胞時，則該方法是可靠的。
[0059] 除了幾個單元的平均密度W外的其他標(biāo)準(zhǔn)也是可能的，該優(yōu)選基于A、B和C組的 子標(biāo)準(zhǔn)的組合。
[0060] A 組
[0061] 1.陽性細(xì)胞的最大數(shù)量（陽性細(xì)胞是指由軟件檢測的染色細(xì)胞）
[0062] 2.陽性細(xì)胞的最大密度
[0063] 3.陽性細(xì)胞數(shù)量的總和
[0064] 4.陽性細(xì)胞表面的總和
[0065] 5.陽性細(xì)胞密度的總和
[0066] 6.陽性細(xì)胞的平均數(shù)
[0067] 7.陽性細(xì)胞的平均密度 [006引 8.陽性細(xì)胞的最大數(shù)
[0069] 9.陽性細(xì)胞的中值數(shù)
[0070] 10.陽性細(xì)胞的中值密度
[0071] 在A組中，標(biāo)準(zhǔn)2、5、7和10是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛紤]分析的組織的表面。
[007引 B組
[007引 1.單陽性細(xì)胞
[0074] 2.包含至少3個陽性細(xì)胞的簇中的陽性細(xì)胞
[0075] 3.單陽性細(xì)胞或包含至少3個陽性細(xì)胞的簇 [007引 4.所有陽性細(xì)胞
[0077] 5.最陽性單元，優(yōu)選S做個陽性單元
[0078] 6.隨機(jī)單元，優(yōu)選H (3)個隨機(jī)單元
[007引在B組中，標(biāo)準(zhǔn)4和5是優(yōu)選的，因?yàn)樵摌?biāo)準(zhǔn)考慮檢測的所有陽性細(xì)胞，并通過選 擇3個最染色單元降低異質(zhì)性。另一方面，使用3到50個隨機(jī)單元允許獲得非?？斓慕Y(jié)果， 因?yàn)樵摮绦蚩蒞避免定量整個腫瘤。染色載片的分析結(jié)果快10-100倍。
[0080] C 組
[0081] 1.腫瘤區(qū)域CT
[0082] 2.腫瘤區(qū)域IM
[0083] 3.腫瘤區(qū)域CT和IM
[0084] 在C組中，標(biāo)準(zhǔn)3 腫瘤區(qū)域CT和IM"是優(yōu)選的，因?yàn)樵摲椒ㄔ趨^(qū)分患者中是最 強(qiáng)大的，并且組之間的風(fēng)險(xiǎn)比是最高的。
[0085] 此類標(biāo)準(zhǔn)的組合的實(shí)例包括例如用于細(xì)胞標(biāo)志物，諸如CD3 ;
[0086]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于評估腫瘤組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量或密度的方法，所述方法包括由w下組成的步 驟： a. 提供通過使用特異性結(jié)合由免疫細(xì)胞表達(dá)的抗原（標(biāo)志物）的抗體的自動化載片染 色系統(tǒng)獲得的一片或多片免疫染色的組織切片， b. 通過高分辨率掃描捕獲將步驟a.的載片進(jìn)行數(shù)字化，由此獲得待分析載片的高清 晰度（4. 6 y m/像素或更好）數(shù)字圖像， C.檢測數(shù)字圖像上的組織切片 d. 分析該片組織切片，用于定義（i)腫瘤（CT)和（ii)腫瘤的侵入性邊緣（IM)， e. 提供尺寸參考網(wǎng)格，其中均勻分布單元具有相同表面，所述網(wǎng)格適于待分析腫瘤的 尺寸， el.檢查免疫染色的質(zhì)量， f. 檢測和定量每個單元的染色細(xì)胞，由此評估每個單元染色的免疫細(xì)胞的數(shù)量或密 度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中每個單元的染色細(xì)胞的檢測和定量分別在腫瘤（CT)和 腫瘤的侵入性邊緣（IM)中實(shí)施。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中沒有提供任何尺寸參考網(wǎng)格。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體選自對于CD3、CD4、CD8、CD20、 CD45R0、或GZMB標(biāo)志物特異性的抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中使用選自W下組合的兩種或H種抗體： CD3+CD8、CD3+CD45R0、CD3+CD20、CD3+GZMB、CD8+CD20、CD8+GZMB、CD8+CD45R0、CD20+GZMB、 CD20+CD45R0、GZMB+CD45R0、CD4+CD8、CD4+CD45R0、CD4+GZMB、CD4+CD20 和 CD3、CD8、CD20、 CD45R0、CD4和GZMB標(biāo)志物中的3種標(biāo)志物的所有組合。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中1肥自動化用于實(shí)施步驟a)。
7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中分析組織切片用于定義（i)腫瘤（CT)和（ii) 腫瘤的侵入性邊緣（IM)的邊界通過適當(dāng)?shù)能浖韺?shí)施。
8. 權(quán)利要求1、2和4至7中任一項(xiàng)的方法，其中使用具有1010^12至100010^12的表 面的六邊形、正方形或矩形單元。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中評估的每個單元的染色的免疫細(xì)胞的數(shù) 量或密度選自： -染色細(xì)胞的最大數(shù)量 -染色細(xì)胞的最大密度 -染色細(xì)胞的數(shù)量總和 -染色細(xì)胞的表面總和 -染色細(xì)胞的密度總和 -染色細(xì)胞的平均數(shù) -染色細(xì)胞的平均密度 -染色細(xì)胞的最大數(shù)量 -染色細(xì)胞數(shù)量的中值。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1、2和4至9中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括根據(jù)選自W下的B組標(biāo) 準(zhǔn)檢測細(xì)胞或單元： -單染色細(xì)胞 -包含至少3個染色細(xì)胞的簇中的染色細(xì)胞 -單染色細(xì)胞或包含至少3個染色細(xì)胞的簇 -所有染色細(xì)胞 -最染色的單元 -隨機(jī)單元。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括根據(jù)患者的預(yù)期存活率或他 們對于癌癥治療的響應(yīng)將患者分組的步驟。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中對于給定標(biāo)志物，將免疫細(xì)胞的數(shù)量或密度的值與 用于所述標(biāo)志物的預(yù)定參考值進(jìn)行比較；所述預(yù)定參考值與所述癌癥進(jìn)展的特定預(yù)后和/ 或患者的存活率和/或?qū)Π┌Y治療的響應(yīng)相關(guān)聯(lián)。
【專利摘要】用于評估腫瘤組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量或密度的方法，所述方法包括由以下組成的步驟：a.提供通過使用特異性結(jié)合由免疫細(xì)胞表達(dá)的抗原(標(biāo)志物)的抗體的自動化載片染色系統(tǒng)獲得的一片或多片免疫染色的組織切片，b.通過高分辨率掃描捕獲進(jìn)行到步驟a.的載片的數(shù)字化，由此獲得待分析載片的高清晰度(4.6μm/像素或更好)數(shù)字圖像，c.檢測數(shù)字圖像上該片組織切片d.分析該片組織切片，用于定義(i)腫瘤(CT)和(ii)腫瘤的侵入性邊緣(IM)，e.提供尺寸參考網(wǎng)格，其中均勻分布單元具有相同表面，所述網(wǎng)格適于待分析腫瘤的尺寸，e1.檢查免疫染色的質(zhì)量，f.檢測和定量每個單元的染色細(xì)胞，由此評估每個單元染色的免疫細(xì)胞的數(shù)量或密度。
【IPC分類】G01N33-50, G01N33-574
【公開號】CN104541167
【申請?zhí)枴緾N201380030888
【發(fā)明人】J·加隆, F·帕熱斯, B·米萊克尼克
【申請人】國家醫(yī)療保健研究所, 雷卡爾巴黎大學(xué), 巴黎公共救濟(jì)院
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2013年6月14日
【公告號】CA2873278A1, EP2861986A1, US20150153349, WO2013186374A1