一種采用在體心臟灌流對魚類腦組織標(biāo)本固定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及一種動物組織標(biāo)本固定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]心臟灌流方法是對動物腦組織進(jìn)行組織切片、病理標(biāo)本制作、免疫組化、原位雜交、原位PCR、腦內(nèi)定位標(biāo)記等研宄的技術(shù)基礎(chǔ)。動物在體心臟灌流技術(shù)是一種組織標(biāo)本前固定方法，是在動物被麻醉的情況下，用固定液進(jìn)行心臟灌流的方法。
[0003]動物腦組織在死亡后由于細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的作用很快會發(fā)生自溶現(xiàn)象，心臟灌流的目的在于在動物死亡前應(yīng)用固定液對腦組織進(jìn)行固定，抑制組織中細(xì)菌的繁殖，防止腐敗，避免腦組織自溶現(xiàn)象的發(fā)生，還可以增加組織硬度，使組織不易變形，維持原有的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，得到形態(tài)完整和狀態(tài)良好的腦組織，并且固定后的組織對染料有不同的親和力，染色后可產(chǎn)生不同的折射率，顏色更為清晰透明，便于觀察硬化組織，更有利于組織切片的觀察。
[0004]目前的在體心臟灌流技術(shù)大多應(yīng)用于陸地動物。
[0005]季正劍等(季正劍，張冬霞，張立波，等.大鼠在體腦組織灌流方法的比較[J].實驗動物與比較醫(yī)學(xué)，2009, 29(6):390-392.)采用不同的方式對大鼠進(jìn)行灌流的比較研宄，篩選出最佳的灌流技術(shù)，即心尖進(jìn)針結(jié)扎腹主動脈組，從心尖位置朝向主動脈插人灌流針，通過左心室直至主動脈；打開腹腔，結(jié)扎腹主動脈；剪開右心耳，插入聚乙烯管，用以液體回流。
[0006]專利號CN 1336540A公開了一種采用心臟灌流法去除組織內(nèi)紅細(xì)胞制備分散的細(xì)胞懸液的方法，對小鼠采用從左心室心尖注射灌流液，從右心室流出的方法進(jìn)行灌流。
[0007]劉乃慧等(劉乃慧，張莉，邵穎，等.在體心臟灌流技術(shù)在大鼠腦組織切片觀察中的應(yīng)用[J].實驗動物科學(xué)與管理，2005 (2)，52-53.)選用SD大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，打開腹腔，從左心室插入灌流針并固定，剪開右心耳，用恒流泵進(jìn)行灌注。
[0008]胡萍等(胡萍，尤家騄，羅正曜.大白鼠心臟再灌流綜合征模型[J].湖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1986，01:15-18.)通過結(jié)扎大白鼠左冠脈主支然后解除結(jié)扎，復(fù)制了大白鼠在體心臟再灌流綜合征模型。
[0009]李靖等(李靖，蕭家思，侯岷.燒傷對豚鼠離體灌流心臟收縮及舒張功能的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1990，06:480-483.)利用順行洼離體灌流心臟模型觀察燒傷對心臟收縮及舒張功能的影響。
[0010]馬曉樂(馬曉樂.甘肅鼢鼠腦圖譜構(gòu)建的研宄[D].陜西師范大學(xué)，2009.)在構(gòu)建鼢鼠腦圖譜研宄中采用從左心室插入主動脈，右心房開口的方式進(jìn)行了心臟灌流，注入固定液的量約為體重的1.5倍。
[0011]通過比較上述文獻(xiàn)心臟灌流方法可知，由于動物的物種差異性和研宄目的性不同，導(dǎo)致心臟灌流的方法也不同。
[0012]水生動物與陸地動物有較大的形態(tài)與生理差異，針對魚類的心臟灌流技術(shù)少有文獻(xiàn)報導(dǎo)。以鯉魚為例，鯉魚心臟只有一心室和一心房，血液循環(huán)為單循環(huán)，無體循環(huán)與肺循環(huán)之分，其血液循環(huán)路線與其他動物不同，進(jìn)針位置和方法以及使用的固定液等也有所差異，而且鯉魚與大鼠、大壁虎等陸地動物的麻醉方法也不同，因此心臟灌流技術(shù)流程必定不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠解決魚腦標(biāo)本固定中存在的組織自溶問題的采用在體心臟灌流對魚類腦組織標(biāo)本固定的方法。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)方案主要是:藥浴法將魚麻醉，開胸手術(shù)，將灌流針經(jīng)心室插入腹大動脈進(jìn)行插管并結(jié)扎固定；將引流針經(jīng)心房進(jìn)行總主靜脈插管并結(jié)扎固定；將引流針連接的流出管放入刻度燒杯中，實時計量并監(jiān)控灌注液與流出液的體積；在心臟灌流開始時，在顱骨上劃四根直線形成長方形，做長方形切口，打開顱腔，暴露出腦；當(dāng)魚腦顏色變白且體積有所增大時，并結(jié)合灌注液與流出液的量來決定灌注時間；停止灌注后，摘取魚腦置于固定液中進(jìn)行固定。
[0015]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0016](I)麻醉動物:采用藥浴法麻醉魚，即將麻醉藥物泡入魚活動的水中，麻醉藥物就會通過魚的鮑部吸收而進(jìn)入到血液中，實現(xiàn)魚的鎮(zhèn)靜或麻醉。
[0017](2)開胸手術(shù):結(jié)合魚的生理和解剖特點(diǎn)，在魚的心臟體表投影區(qū)域附近開胸，用手術(shù)刀從魚腹鰭前端與體軸垂直方向交點(diǎn)開始沿腹中線向前經(jīng)胸鰭剪至下頒處，再用剪刀沿腹鰭前的開口向背方剪到脊柱，沿脊柱下緣剪到鰓蓋后面，除去左側(cè)肌肉，打開胸腔的心臟體表投影區(qū)域，保留鰓蓋，暴露出心室、腹大動脈、心房、總主靜脈。
[0018](3)雙管插管:進(jìn)行經(jīng)心室的腹大動脈插管，用手術(shù)線結(jié)扎腹大動脈固定灌流針，經(jīng)心房進(jìn)行總主靜脈插管，手術(shù)線結(jié)扎總主靜脈固定引流針。
[0019](4)心臟灌流:在完成插管并固定后，再將魚固定，將灌流針連接的灌流管通向恒速灌注泵，將引流針連接的流出管放入刻度容器中，實時計量并監(jiān)控灌注液與流出液的體積，開啟恒速灌注泵進(jìn)行心臟灌流，先灌注生理鹽水置換血液，后灌注濃度為10%福爾馬林溶液。
[0020](5)開顱手術(shù):在心臟灌流開始后，根據(jù)魚顱骨的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和尺寸，立即以魚嘴至頭部與軀干交接處即頭部與軀干第一片魚鱗交界點(diǎn)為參照點(diǎn)，與頭部正中線垂直方向用鈍物劃一直線，以左右眼眶上邊緣為基準(zhǔn)，平行于正中線各劃一直線，以左右眼眶后邊緣為參照點(diǎn)垂直于正中線劃一連線，四條直線相交形成長方形，沿四根直線在顱骨上做出長方形切口，打開顱腔，去除腦表面的腦脊液和脂肪組織，暴露出腦組織。
[0021](6)停止灌注:當(dāng)觀察到魚腦的顏色變白且體積有所增大時，灌注的福爾馬林的量為魚體重的1.5倍時，停止灌注，立即摘取魚腦組織放置于10%福爾馬林溶液中進(jìn)行標(biāo)本固定48小時。
[0022]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0023]1、能夠有效解決魚類腦組織的固定不充分、固定區(qū)域不全面、組織自溶、細(xì)胞變形等問題，容易獲得結(jié)構(gòu)更完整及狀態(tài)更理想的腦組織標(biāo)本，能夠更好地保留其自然形態(tài)，可很好應(yīng)用于腦組織切片的制作、染色、標(biāo)記等方面；
[0024]2、能夠有效避免出血過多、損傷過大，可以較為容易的尋找到插管位置；
[0025]3、所采用的插管及結(jié)扎方法能夠?qū)⒐嗔麽樅鸵麽樳M(jìn)行有效固定，防止在移動魚體時出現(xiàn)脫落；
[0026]4、灌流過程中進(jìn)行開顱觀察可以更為準(zhǔn)確的判斷灌流效果并可以在灌流停止后快速提取腦標(biāo)本，結(jié)合流出液體的顏色及流出量能夠有效確定灌流停止時間。
[0027]5、可為組織切片、病理標(biāo)本制作、免疫組化、原位雜交、原位PCR、腦內(nèi)定位標(biāo)記等方面的應(yīng)用提供新技術(shù)。
【附圖說明】
[0028]圖1是鯉魚心臟灌流實驗圖；
[0029]圖2是用常規(guī)方法未心臟灌流制作的腦組織切片圖；
[0030]圖3是用本發(fā)明進(jìn)行心臟灌流制作的腦組織切片圖；
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]實驗動物:健康成年鯉魚，體重1.13kg，體長36.52cm，購于秦皇島市水產(chǎn)市場。
[0033]主要試劑:丁香酚(上海醫(yī)療器械股份有限公司齒科材料廠，批號201103)，生理鹽水、蒸餾水、中性紅、中性樹膠、石蠟、二甲苯、無水乙醇、10 %福爾馬林溶液、2 %鹽酸溶液。
[0034]主要儀器:BQ50S微流量調(diào)速型蠕動泵(保定雷弗流體科技有限公司)、7002模具電磨(永康市喜克萊工具有限公司)、RM2235型組織切片機(jī)(德國Leica公司)、TS100型倒置生物顯微鏡(日本Nikon公司)、HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金