一種高時(shí)空分辨光學(xué)檢測(cè)與顯微成像方法與裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高時(shí)空分辨光學(xué)檢測(cè)與顯微成像方法與裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]成像技術(shù)是當(dāng)前乃至今后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)期生命科學(xué)，包括生物學(xué)醫(yī)學(xué)及其相關(guān)交叉學(xué)科研宄中的重用技術(shù)和手段，其地位猶如基因重組和DNA測(cè)序技術(shù)一樣重要。特別地，以活細(xì)胞、單分子為主要研宄對(duì)象的分子影像新技術(shù)，近年來(lái)在細(xì)胞和分子水平上對(duì)生物過(guò)程開(kāi)展在體測(cè)量與表征上不斷取得新的發(fā)展與突破，其發(fā)展趨勢(shì)是更高的空間分辨率、更快的速度以及動(dòng)態(tài)生物信息獲取等。光學(xué)成像技術(shù)由于具有無(wú)損傷、非侵入性、快速獲取等特點(diǎn)，在活細(xì)胞成像方面具有其它技術(shù)無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)，因此，光學(xué)顯微成像新技術(shù)成為當(dāng)前分子影像新技術(shù)發(fā)展的前沿與熱點(diǎn)。
[0003]由于受到光學(xué)衍射極限的限制，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能達(dá)到波長(zhǎng)量級(jí)的橫向空間分辨率(約為200多納米)，該尺度遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)等生物分子的尺寸；為了突破此空間分辨率限制，近年來(lái)，各國(guó)科學(xué)家發(fā)展了多種超越衍射極限的熒光光學(xué)顯微成像技術(shù)，如受激輻射耗損顯微術(shù)(STED)、光激活定位顯微術(shù)(PALM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)(STORM)等。這些超越衍射極限分辨能力的光學(xué)顯微成像技術(shù)目前有的已經(jīng)可以達(dá)到10_50nm的橫向空間分辨能力，從而可以對(duì)諸如細(xì)胞突觸囊泡的輸運(yùn)和胞呑或胞吐等重要生物學(xué)問(wèn)題開(kāi)展研宄。然而，雖然這些光學(xué)超分辨成像技術(shù)已經(jīng)具備了分子水平的空間分辨能力，但它們只是提供細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程某一時(shí)刻的靜態(tài)狀態(tài)，即使是每秒可達(dá)14幀以上的視頻圖像，也僅是分子一系列動(dòng)力學(xué)過(guò)程的綜合反映，而無(wú)法揭示或顯示分子之間實(shí)時(shí)、快速的相互作用過(guò)程，因?yàn)檫@些過(guò)程的時(shí)間尺度一般是ms量級(jí)或者更快。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種具有超越衍射極限空間分辨能力和時(shí)間快速獲取的高時(shí)空分辨光學(xué)檢測(cè)與顯微成像方法與裝置，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞膜上特定微區(qū)(幾十納米)中相關(guān)分子事件如分子間相互作用過(guò)程等進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的觀察和研宄。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種技術(shù)方案:一種高時(shí)空分辨光學(xué)檢測(cè)與顯微成像裝置，包括:
一激光器系統(tǒng)，用來(lái)產(chǎn)生和發(fā)射一束或兩束的激光光束；
一光束傳輸和控制相關(guān)光電元器件，其包含第一光路光電元器件、第二光路光電元器件以及兩光路耦合傳輸光電元器件組成，所述第一光路光電元器件用來(lái)傳輸和控制第一光路的激光光束，所述第二光路光電元器件用來(lái)傳輸和控制第二光路的激光光束，所述兩光路親合傳輸光電元器件用來(lái)親合和傳輸兩路的激光光束；
一光學(xué)顯微鏡，利用一路或耦合后的兩路激光光束照射樣品、檢測(cè)與成像；以及一微弱信號(hào)光電探測(cè)器件，用來(lái)對(duì)圖像中預(yù)定區(qū)域?qū)崿F(xiàn)單通道或雙通道的時(shí)間相關(guān)光譜計(jì)數(shù)與檢測(cè)。
[0006]進(jìn)一步的，所述第一光路光電元器件包括沿第一光路傳輸方向依次設(shè)置的光開(kāi)關(guān)、第一 1/2玻片、偏振分光片、脈沖展寬部件、第一反射鏡、時(shí)間延遲單元、第二反射鏡、第二1/2玻片、偏振片、第三反射鏡、會(huì)聚透鏡、單模保偏光纖、低倍率物鏡、第五反射鏡以及渦旋相位板。
[0007]進(jìn)一步的，所述第二光路光電元器件包括沿第二光路傳輸方向依次設(shè)置的光學(xué)參量振蕩器、第四反射鏡以及陷波濾光片。
[0008]進(jìn)一步的，所述兩光路耦合傳輸光電元器件包括沿兩光路耦合傳輸方向依次設(shè)置的第一二色鏡、第六反射鏡、第三1/2玻片、1/4玻片以及第二二色鏡，所述第一光路的激光光束經(jīng)第一二色鏡透射至第六反射鏡，所述第二光路的激光光束經(jīng)第一二色鏡反射至第六反射鏡。
[0009]進(jìn)一步的，所述光學(xué)顯微鏡由樣品臺(tái)、成像物鏡、激光掃描單元、第三二色鏡、第三帶通濾光片以及光電倍增管組成，所述第二二色鏡反射出的激光光束進(jìn)入激光掃描單元，并經(jīng)第三二色鏡反射后，通過(guò)成像物鏡照射在樣品臺(tái)上面的樣品上；所述樣品上出射的后向雙光子熒光信號(hào)返回通過(guò)成像物鏡，并經(jīng)第三二色鏡透射后，通過(guò)第三帶通濾光片被光電倍增管所檢測(cè)成像。
[0010]進(jìn)一步的，所述微弱信號(hào)光電探測(cè)器件包括路由器、第一帶通濾光片、第二帶通濾光片、第一光電探測(cè)器、第二光電探測(cè)器、時(shí)間相關(guān)光子計(jì)數(shù)器以及數(shù)據(jù)采集與分析設(shè)備，所述第一帶通濾光片和第一光電探測(cè)器組成了第一通道，所述第二帶通濾光片和第二光電探測(cè)器組成了第二通道。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了另一種技術(shù)方案:一種高時(shí)空分辨光學(xué)檢測(cè)與顯微成像方法，包括以下兩種工作模式:
(1)單光束的雙光子成像工作模式:當(dāng)光開(kāi)關(guān)處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)，激光器系統(tǒng)僅出射一束超短脈沖激光，激光光束經(jīng)過(guò)光學(xué)參量振蕩器實(shí)現(xiàn)波長(zhǎng)的調(diào)節(jié)與控制后，接著依次經(jīng)過(guò)第四反射鏡、陷波濾光片、第一二色鏡、第六反射鏡、第三1/2玻片、1/4玻片和第二二色鏡，然后反射進(jìn)入光學(xué)顯微鏡的激光掃描單元，并經(jīng)第三二色鏡反射通過(guò)成像物鏡，最后照射在樣品臺(tái)上面的樣品上；樣品上出射的后向雙光子熒光信號(hào)返回經(jīng)過(guò)成像物鏡，并經(jīng)第三二色鏡透射通過(guò)第三帶通濾光片，最后被光電倍增管所檢測(cè)，從而獲得樣品中相關(guān)物質(zhì)的高分辨雙光子熒光圖像；選擇熒光圖像中的預(yù)定區(qū)域，對(duì)此區(qū)域中的預(yù)定分子進(jìn)行標(biāo)記，并讓激光掃描單元的工作方式為點(diǎn)掃描，此時(shí)區(qū)域中被標(biāo)記的預(yù)定分子的快速動(dòng)力學(xué)過(guò)程包括相互作用過(guò)程的相關(guān)信號(hào)依次經(jīng)過(guò)成像物鏡、第三二色鏡、激光掃描單元、第二二色鏡、路由器、第一帶通濾光片和/或第二帶通濾光片、第一光電探測(cè)器和/或第二光電探測(cè)器以及時(shí)間相關(guān)光子計(jì)數(shù)器，最后到達(dá)數(shù)據(jù)采集與分析設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)高空間分辨預(yù)定區(qū)域相關(guān)生物信息的快速獲取與檢測(cè)；
(2)雙光束的超越衍射極限工作模式:當(dāng)光開(kāi)關(guān)處于打開(kāi)狀態(tài)時(shí)，激光系統(tǒng)出射兩束超短脈沖激光，其中第一激光光束依次經(jīng)過(guò)第一 1/2玻片、偏振分光片、脈沖展寬部件、第一反射鏡、時(shí)間延遲單元、第二反射鏡、第二 1/2玻片、偏振片、第三反射鏡、會(huì)聚透鏡、單模保偏光纖、低倍率物鏡、第五反射鏡和渦旋相位板后，獲得預(yù)定光強(qiáng)分布的圓偏振光；而第二激光光束經(jīng)過(guò)光學(xué)參量振蕩器實(shí)現(xiàn)波長(zhǎng)的調(diào)節(jié)與控制后，接著依次經(jīng)過(guò)第四反射鏡和陷波濾光片；兩激光光束在第一二色鏡上進(jìn)行時(shí)間和空間上的同步耦合，并依次經(jīng)過(guò)第六反射鏡、第三1/2玻片、1/4玻片和第二二色鏡，然后反射進(jìn)入光學(xué)顯微鏡的激光掃描單元，并經(jīng)第三二色鏡反射通過(guò)成像物鏡，最后照射在樣品臺(tái)上面的樣品上；樣品上出射的后向超越衍射極限的熒光信號(hào)返回經(jīng)過(guò)成像物鏡，并經(jīng)第三二色鏡透射通過(guò)第三帶通濾光片，最后被光電倍增管所檢測(cè)，從而獲得樣品中相關(guān)物質(zhì)的高分辨雙光子熒光圖像；選擇熒光圖像中的預(yù)定區(qū)域，對(duì)此區(qū)域中的預(yù)定分子進(jìn)行標(biāo)記，并讓激光掃描單元的工作方式為點(diǎn)掃描，此時(shí)區(qū)域中被標(biāo)記的預(yù)定分子的快速動(dòng)力學(xué)過(guò)程包括相互作用過(guò)程的相關(guān)信號(hào)依次經(jīng)過(guò)成像物鏡、第三二色鏡、激光掃描單元、第二二色鏡、路由器、第一帶通濾光片和/或第二帶通濾光片、第一光電探測(cè)器和/或第二光電探測(cè)器以及時(shí)間相關(guān)光子計(jì)數(shù)器，最后到達(dá)數(shù)據(jù)采集與分析設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)高空間分辨預(yù)定區(qū)域相關(guān)生物信息的快速獲取與檢測(cè)。
[0012]與現(xiàn)