一種對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及顯微成像領(lǐng)域，特別涉及一種在醫(yī)用生物領(lǐng)域?qū)晒馕镔|(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞作為生命活動(dòng)的基本單元，是深入研宄生命過程的關(guān)鍵。了解各種大分子在活細(xì)胞中構(gòu)象改變和精確定位，揭示生物分子相互作用關(guān)系，對(duì)于研宄疾病機(jī)理、促進(jìn)生物醫(yī)藥科學(xué)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。而實(shí)現(xiàn)這些的關(guān)鍵在于細(xì)胞的觀察及檢測。
[0003]目前，激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy)是細(xì)胞原位觀察的重要工具，然而，受到光學(xué)衍射限制，激光掃描共聚焦顯微鏡的成像分辨率在200?300nm，隨著觀察和原位檢測的深入，需要對(duì)尺寸在20?200nm的病毒、單鏈或雙鏈DNA實(shí)現(xiàn)觀察和檢測，在這些情況下，共聚焦顯微鏡就無法分辨。為了突破光學(xué)衍射極限，近年來涌現(xiàn)出了不少超分辨光學(xué)顯微成像方法，如光激活定位法(Photoactivat1nLocalizat1n Microscopy，PALM)、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)法(Stochastic Optical Reconstruct1nMicroscopy，STORM)、結(jié)構(gòu)光照明法(Structured Illuminat1n Microscopy, SIM)以及受激發(fā)射損耗法(Stimulated Emiss1n Deplet1n，STED)等。相比其他的方法，STED方法是一種更為直觀的方法，它以傳統(tǒng)共聚焦顯微光學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過把被激發(fā)的熒光物質(zhì)限制在小于衍射極限的范圍內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)超高分辨率，其成像方式無需復(fù)雜的后期圖像處理，因此STED技術(shù)被認(rèn)為是下一代顯微光學(xué)發(fā)展的核心技術(shù)，是光學(xué)最前沿理論與技術(shù)實(shí)踐的結(jié)合。
[0004]STED顯微成像系統(tǒng)有多種實(shí)現(xiàn)方法，但大部分STED系統(tǒng)十分復(fù)雜，這些STED系統(tǒng)多采用兩組激光光源，且該類系統(tǒng)通過增加反射鏡的數(shù)量來增加光行進(jìn)的距離，這帶來兩方面的問題，一是系統(tǒng)裝校過程十分復(fù)雜，每個(gè)反射鏡在每次使用時(shí)都必須精確調(diào)校，耗時(shí)費(fèi)力，即使是對(duì)從事STED顯微鏡系統(tǒng)開發(fā)的科研人員來說也是一項(xiàng)十分具有挑戰(zhàn)性的工作；二是系統(tǒng)的可靠性非常低，用戶在使用時(shí)經(jīng)常遇到系統(tǒng)需要重新校準(zhǔn)，這在很大程度上限制了 STED超分辨顯微鏡的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為減小STED系統(tǒng)的復(fù)雜性，本發(fā)明采用超連續(xù)譜脈沖光源同時(shí)作為激發(fā)光光源和損耗光光源，此外，為使得激發(fā)光和損耗光在時(shí)間上保持嚴(yán)格的同步關(guān)系，本發(fā)明在損耗光路中采用雙光楔對(duì)光程進(jìn)行補(bǔ)償，使得激發(fā)光和損耗光先后進(jìn)入物鏡，兩路光在時(shí)間上保持幾皮秒的延時(shí)，以獲得對(duì)熒光最佳的損耗效果。同時(shí)，采用脈沖光作為激發(fā)光和損耗光也減小了光照對(duì)熒光物質(zhì)的漂白。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]—種對(duì)焚光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，它包括:第一光路，其中的光線的波長選擇為適于激發(fā)該待成像的熒光物質(zhì)產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子的波長；
[0008]第二光路，其中設(shè)置有相位板，以使所述第二光路的照射面形成為環(huán)形光斑，且所述第二光路中光線的波長選擇為不能激發(fā)該待成像的熒光物質(zhì)產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子的波長；
[0009]雙光楔光程補(bǔ)償裝置，其設(shè)置在所述第二光路中，所述雙光楔光程補(bǔ)償裝置由折射率大于空氣折射率的透光材料制成，且所述光程調(diào)節(jié)器包括兩個(gè)含斜邊的光楔，兩個(gè)光楔的斜邊彼此可滑動(dòng)移動(dòng)地貼合，所述第二光路中的光線穿過兩個(gè)光楔的貼合部分。
[0010]優(yōu)選的是，所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，包括:
[0011]光源，其為超連續(xù)譜脈沖激光源，用于發(fā)射波長范圍較寬的脈沖光；
[0012]第一二色鏡，其用于將所述波長范圍較寬的脈沖光分解為長波長和短波長兩路光，其中短波長光波行進(jìn)的光路為激發(fā)光光路，長波長光波行進(jìn)的光路為損耗光光路；
[0013]第一濾光片，其位于所述激發(fā)光光路上，且只允許一個(gè)特定波長的激光透射，該透射出的特定波長的激光為激發(fā)光；
[0014]第二濾光片，其位于所述損耗光光路上，且只允許一個(gè)特定波長的激光透射，該透射出的特定波長的激光為損耗光；
[0015]所述激發(fā)光和損耗光均垂直照射于熒光物質(zhì)上的同一位置；
[0016]相位板，其位于所述損耗光的光路上，具有O?2 的渦旋相位分布，用于將所述損耗光的照射面由實(shí)心的光斑轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g無光周圈有光的圓環(huán)空心光斑；
[0017]雙光楔光程補(bǔ)償裝置，其位于所述損耗光的光路上，由折射率大于空氣折射率的透光材料組成，當(dāng)損耗光穿過所述雙光楔光程補(bǔ)償裝置時(shí)，損耗光的傳播速度小于它在空氣中的傳播速度，從而使得所述激發(fā)光和損耗光產(chǎn)生一個(gè)時(shí)間差先后到達(dá)熒光物質(zhì)，且激發(fā)光先于損耗光到達(dá)熒光物質(zhì)，所述雙光楔光程補(bǔ)償裝置通過自由調(diào)節(jié)損耗光在雙光楔光程補(bǔ)償裝置中的傳播距離，來控制所述時(shí)間差的大??；
[0018]熒光探測系統(tǒng)，其用于檢測熒光及其強(qiáng)度；
[0019]分析控制系統(tǒng)，其與所述熒光探測系統(tǒng)電連接，用于記錄和分析熒光強(qiáng)度，并最終實(shí)現(xiàn)顯微成像；
[0020]其中，通過調(diào)節(jié)所述雙光楔光程補(bǔ)償裝置來改變時(shí)間差的大小，以使得所述激發(fā)光先照射熒光物質(zhì)，待熒光物質(zhì)中的熒光粒子從基態(tài)躍迀至激發(fā)態(tài)之后，且在該處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子發(fā)出熒光之前，損耗光剛好照射到熒光物質(zhì)，使熒光物質(zhì)受激輻射，以迫使已經(jīng)處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子躍迀至其他能級(jí)，從而通過后續(xù)光學(xué)器件以濾除損耗區(qū)域的熒光信號(hào)。
[0021]優(yōu)選的是，所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，所述光楔呈直角梯形或直角三角形。
[0022]優(yōu)選的是，所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，還包括:
[0023]三維納米位移臺(tái)，其與所述分析控制系統(tǒng)電連接，用于承載熒光物質(zhì)，并在X、Y、Z方向自由地進(jìn)行以納米為單位的移動(dòng)；
[0024]物鏡，其位于熒光物質(zhì)上方，用于聚焦激發(fā)光和損耗光，并收集由熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光；
[0025]第三濾光片，其位于熒光光路上，用于濾除干擾光，透射熒光；
[0026]透鏡，其位于所述第三濾光片和熒光探測系統(tǒng)之間，用于聚焦熒光；
[0027]針孔，其位于所述透鏡和熒光探測系統(tǒng)之間，用于濾除干擾光。
[0028]優(yōu)選的是，所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，還包括:
[0029]反射鏡，其位于所述第二濾光片和相位板之間，用于反射損耗光；
[0030]第二二色鏡，其位于所述第三濾光片和物鏡之間，用于反射所述激發(fā)光和透射熒光;
[0031]第三二色鏡，其位于所述第二二色鏡和物鏡之間，用于反射所述損耗光，透射激發(fā)光和熒光。
[0032]優(yōu)選的是，所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，所述激發(fā)光從所述光源出發(fā)，依次經(jīng)過第一二色鏡、第一濾光片、第二二色鏡、第三二色鏡和物鏡，最終到達(dá)熒光物質(zhì)。
[0033]優(yōu)選的是，所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，所述損耗光從所述光源出發(fā)，依次經(jīng)過第一二色鏡、第二濾光片、反射鏡、相位板、雙光楔光程補(bǔ)償裝置、第三二色鏡和物鏡，最終到達(dá)熒光物質(zhì)。
[0034]優(yōu)選的是，所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，所述熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光依次經(jīng)過物鏡、第三二色鏡、第二二色鏡、第三濾光片、透鏡和針孔，最終到達(dá)熒光探測系統(tǒng)。
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