一種dna電化學(xué)生物傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于材料制備和檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種傳感器及其制作方法，尤其是一種DNA電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，應(yīng)用于核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳信息的承擔(dān)者，DNA分子中堿基序列的變異與人類許多遺傳疾病有關(guān)。因此，對(duì)特定序列的DNA的分析以及對(duì)DNA鏈中堿基突變的檢測(cè)在基因篩選、遺傳疾病的早期診斷和治療方面具有十分深遠(yuǎn)的意義。DNA生物傳感器是進(jìn)行核酸的結(jié)構(gòu)分析和檢測(cè)的重要手段，在眾多的雜交檢測(cè)方法中，電化學(xué)分析技術(shù)具有儀器簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、測(cè)定快速準(zhǔn)確和方法靈敏度高等特點(diǎn)，因而受到了廣泛關(guān)注。DNA電化學(xué)傳感器在DNA分子識(shí)別和檢測(cè)中的應(yīng)用研宄已有不少報(bào)道。電化學(xué)DNA生物傳感器的靈敏度直接依賴于雜交指示劑對(duì)dsDNA的選擇性。具有電活性的嵌入劑是研宄得較多的一類雜交指示劑，但是，它們往往同時(shí)與單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA (dsDNA)相結(jié)合，因而其選擇性不夠理想。由于導(dǎo)電納米材料一般具有比表面積大、生物相容性好及導(dǎo)電性好等特點(diǎn)，常被應(yīng)用核酸電化學(xué)傳感器的構(gòu)建。
[0003]碳元素是自然界中廣泛存在的與人類密切相關(guān)的元素之一，電子軌道雜化多樣性(sp、sp2、sp3雜化)使得以碳元素為唯一構(gòu)成元素的碳材料具有各式各樣的存在形式。1985年發(fā)現(xiàn)的富勒烯和1991年發(fā)現(xiàn)的碳納米管已經(jīng)成為碳材料研宄的熱點(diǎn)。2004年英國(guó)Manchester大學(xué)的Geim小組首次用機(jī)械剝離法成功制得了以碳原子sp2雜化構(gòu)成的單原子層二維晶體(石墨烯)，它是碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的碳質(zhì)材料，是世界上最薄的二維材料(單原子厚度的材料)。碳納米材料有優(yōu)異的光學(xué)、熱力學(xué)、力學(xué)性能、大的比表面積以及很強(qiáng)的電子傳導(dǎo)能力等，這些優(yōu)異的性能使得碳納米材料在傳感器、超級(jí)電容器、納米電子器件及復(fù)合材料等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。金屬納米顆粒同樣具有比表面積大、表面反應(yīng)活性好、催化效率高以及吸附能力強(qiáng)的特點(diǎn)，在電化學(xué)反應(yīng)中可以作為優(yōu)良的電子傳遞媒介。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種DNA電化學(xué)傳感器及其制備方法。檢測(cè)原理是基于固定化DNA分子探針和導(dǎo)電納米材料結(jié)合，使得溶液中的電化學(xué)活性試劑能夠響應(yīng)DNA雜交事件，從而實(shí)現(xiàn)以電化學(xué)方法進(jìn)行DNA檢測(cè)。本發(fā)明提供一種新穎的電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換方式用于DNA電化學(xué)檢測(cè)。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:一種DNA電化學(xué)生物傳感器，
[0006]以金電極作為基底電極，利用Au-S鍵化學(xué)作用將巰基化ssDNA分子探針修飾到基底電極上，封閉電極的多余位點(diǎn)，以與ssDNA結(jié)合的導(dǎo)電納米材料作為電化學(xué)轉(zhuǎn)換器，利用可溶性電化學(xué)活性試劑的電極反應(yīng)變化來(lái)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)。利用DNA序列之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用，通過(guò)電化學(xué)信號(hào)的表征，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物DNA的檢測(cè)。
[0007]進(jìn)一步，所述的可溶性電化學(xué)活性試劑為帶負(fù)電荷的電化學(xué)活性試劑，其電極反應(yīng)能夠被DNA修飾電極所阻擋；這類電化學(xué)活性試劑包括但不限于鐵氰化鉀和六氯合銥。
[0008]進(jìn)一步，目標(biāo)DNA與探針DNA發(fā)生雜交反應(yīng)時(shí)，能夠去除電極表面的石墨納米顆粒，從而抑制了可溶性電化學(xué)試劑的電極反應(yīng)。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供上述的DNA電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其包括以下步驟:
[0010]步驟⑴:ssDNA探針修飾金電極的制備:先將金電極分別用0.3 μπι、50 μπι的拋光粉進(jìn)行拋光5min，再分別用丙酮、乙醇、超純水進(jìn)行超聲清洗，超聲清洗的時(shí)間分別為3?5min。最后，將上述電極放入0.1?0.3mol/L的稀H2SO4*，進(jìn)行電化學(xué)清洗，即得干凈的金電極；將已經(jīng)過(guò)潔凈處理的金電極浸泡在巰基化ssDNA探針溶液中進(jìn)行探針修飾，再將該電極浸泡在巰基己醇溶液中以封閉電極多余位點(diǎn)，即可得到DNA探針修飾金電極。
[0011]步驟⑵:DNA電化學(xué)生物傳感器的制備:將DNA探針修飾金電極浸泡在含有導(dǎo)電納米材料的溶液中，反應(yīng)一段時(shí)間，即得電化學(xué)DNA生物傳感器。
[0012]進(jìn)一步，步驟(I)中，反應(yīng)溫度為15?35°C，單鏈DNA探針的修飾時(shí)間為16?24小時(shí)，ssDNA探針溶液的濃度為0.01?10 μ mol/L，巰基己醇濃度為0.1?10mmol/L。
[0013]進(jìn)一步，所述步驟(2)中，反應(yīng)溫度為15?35°C，反應(yīng)時(shí)間為0.5?2小時(shí)，溶液濃度為0.5?5mg/mL。
[0014]上述巰基化DNA探針溶液的配制:將巰基化單鏈DNA溶解在pH 7.0的磷酸緩沖溶液(含lmol/LNaCl)中，濃度為0.01?10 μmol/L，巰基己醇濃度為0.1?10mmol/L。
[0015]DNA電化學(xué)傳感器的制備:將ssDNA探針修飾金電極浸泡在0.5?5mg/mL的導(dǎo)電納米顆粒溶液中0.5?4h反應(yīng)，即得。
[0016]進(jìn)一步，所述導(dǎo)電納米材料為碳納米材料或金屬納米材料。
[0017]進(jìn)一步，所述碳納米材料為石墨納米顆粒、石墨稀、氧化石墨稀、還原氧化石墨稀、石墨烯量子點(diǎn)、單壁碳納米管、多壁碳納米管、羧基化碳納米管或氨基化碳納米管。
[0018]進(jìn)一步，所述金屬納米材料為納米金、納米銀、納米銅、納米鋅或納米鉬及復(fù)合顆粒。
[0019]進(jìn)一步，其特征在于所述的可溶性電化學(xué)活性試劑為帶負(fù)電荷的電化學(xué)活性試劑。
[0020]本發(fā)明中互補(bǔ)DNA (檢測(cè)探針DNA及捕獲探針DNA)和巰基修飾可采用任何現(xiàn)有技術(shù)或商業(yè)途徑獲得。
[0021]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下顯而易見(jiàn)的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn):
[0022]1、提供了一種DNA探針進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的通用方法。
[0023]2、引入導(dǎo)電納米顆粒以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA雜交事件的電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換。
[0024]3, DNA分子探針與目標(biāo)物結(jié)合特異性高，檢測(cè)更加準(zhǔn)確，減少了假陽(yáng)性反應(yīng)。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是本發(fā)明“一種基于石墨納米顆粒的DNA電化學(xué)生物傳感器”的示意圖。
[0026]圖2是該傳感器每一步電極修飾過(guò)程的循環(huán)伏安圖。
[0027]其中a是裸金電極的循環(huán)伏安曲線。
[0028]b是修飾了巰基DNA和巰基己醇的金電極循環(huán)伏安曲線。
[0029]C是修飾了巰基DNA和巰基己醇及石墨納米顆粒之后的金電極循環(huán)伏安曲線。
[0030]d是已修飾的金電極檢測(cè)目標(biāo)鏈DNA之后的循環(huán)伏安曲線。
[0031]圖3是該傳感器每一步電極修飾過(guò)程的阻抗圖。
[0032]其中a是裸金電極的阻抗曲線。
[0033]b是修飾了巰基DNA和巰基己醇的金電極的阻抗曲線。
[0034]C是修飾了巰基DNA和巰基己醇及石墨納米顆粒之后的金電極的阻抗曲線。
[0035]d是已修飾的金電極檢測(cè)目標(biāo)鏈DNA之后的阻抗曲線。
[0036]圖4是該傳感器對(duì)完全互補(bǔ)DNA鏈檢測(cè)的脈沖伏安圖。
[0037]其中a是裸金電極的脈沖伏安曲線。
[0038]b是修飾了巰基DNA和巰基己醇的金電極的脈沖伏安曲線。
[0039]C是修飾了巰基DNA和巰基己醇及石墨納米顆粒之后的金電極的脈沖伏安曲線。
[0040]d是已修飾的金電極檢測(cè)完全互補(bǔ)配對(duì)DNA之后的脈沖伏安曲線。
[0041 ]圖5是該傳感器對(duì)單堿基錯(cuò)配DNA鏈檢測(cè)的脈沖伏安圖。
[0042]其中a是裸金電極的脈沖伏安曲線。
[0043]b是修飾了巰基DNA和巰基己醇的金電極的脈沖伏安曲線。
[0044]C是修飾了巰基DNA和巰基己醇及石墨納米顆粒之后的金電極的脈沖伏安曲線。
[0045]d是已修飾的金電極檢測(cè)單堿基錯(cuò)配DNA之后的金電極的脈沖伏安曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0046]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0047]實(shí)施例1
[0048]1、金電極的預(yù)處理:將金電極分別用0.3 μm>50nm的拋光粉進(jìn)行拋光5min，再分別用丙酮、乙醇、超純水進(jìn)行