一種幽門(mén)螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒的制作方法
【專利說(shuō)明】-種幽口螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒
[OOOU 本申請(qǐng)為申請(qǐng)日為2012年11月26日，申請(qǐng)?zhí)枮?01210486563. 7,發(fā)明創(chuàng)造名稱 為"一種幽口螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒"的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是設(shè)及一種幽口螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003] 幽口螺桿菌Ofelicobacter Pylori)，簡(jiǎn)稱HP，1983年由澳大利亞學(xué)者Bairy Marshall和Robin Warren首次從胃粘膜組織分離得到。經(jīng)過(guò)各國(guó)學(xué)者多年的研究證實(shí)， 化在慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等消化道疾病致病中起重要作用。HP的發(fā)現(xiàn)是胃腸病學(xué) 史上一個(gè)革命性進(jìn)展，2005年Robin Warren和Barry Marshall因此獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
[0004] HP與胃十二指腸疾病的關(guān)系，一直是各國(guó)學(xué)者研究的主要課題。大量的流行病學(xué) 調(diào)查證實(shí)，自然人群中HP感染率相當(dāng)高，HP在全球人群的感染率超過(guò)50%，而且隨著年齡 的增加有遞增趨勢(shì)，而且感染情況與致病性因地域不同有很大差異，不同國(guó)家和地區(qū)分離 的HP菌株基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)人群或地區(qū)性差異，因此HP致病差異性已引起人們重視。較多的 研究表明HP的致病性主要與菌型差異、感染的年齡及機(jī)體的反應(yīng)性、地域性、飲食習(xí)慣等 有關(guān)。
[0005] 目前臨床上按照是否表達(dá)致病因子細(xì)胞毒素蛋白KagA)和空泡毒素蛋白（VacA) 將HP分為兩型；1型為產(chǎn)細(xì)胞毒素的HP,化gA和VacA均表達(dá)或有任一表達(dá)，其致病力強(qiáng)， 易引起胃部疾??；II型為不產(chǎn)細(xì)胞毒素的HP，化gA和VacA均不表達(dá)，其毒性較弱，感染后 一般無(wú)明顯臨床癥狀。所W臨床上不能僅限于檢出HP，進(jìn)一步HP分型檢測(cè)對(duì)臨床消化道疾 病的診斷和治療具有重要的參考價(jià)值。
[0006] 根據(jù)國(guó)際最新的Maastricht-Ill共識(shí)意見(jiàn)和我國(guó)幽口螺桿菌診治共識(shí)意見(jiàn) (2007)，檢測(cè)化感染的方法有侵入性和非侵入性兩類。侵入性方法依賴胃鏡活檢，包括快 速尿素酶試驗(yàn)（RUT)、胃黏膜直接涂片染色鏡檢、胃黏膜組織切片染色鏡檢（如WS銀染、改 良Giemsa染色、甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化染色）、細(xì)菌培養(yǎng)、基因檢測(cè)方法、免疫快速尿素酶 試驗(yàn)（IRUT)。而非侵入性檢測(cè)方法不依賴內(nèi)鏡檢查，包括13C或14C-尿素呼氣試驗(yàn)扣BT)、 糞便化抗原化pSA)檢測(cè)（依檢測(cè)抗體可分為單抗和多抗兩類）、血清和分泌物（唾液、尿 液等）抗體檢測(cè)、基因巧片和蛋白巧片檢測(cè)等。由于侵入性方法采樣需借助胃鏡檢查，許多 患者不愿接受，因而受限制，難W作為大樣本進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。而非侵入性方法，患者依 從性較好，因而有其實(shí)際意義。然而W上的檢測(cè)方法僅限于檢出是否有HP感染，均不能對(duì) HP分型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)HP僅能檢出是否有HP感染而 不能對(duì)HP分型進(jìn)行分型的缺陷，提供一種幽口螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒。
[000引為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 一種幽口螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒，包括轉(zhuǎn)印有經(jīng)電泳分離的幽口螺桿菌全菌體 蛋白的印跡膜。
[0010] 患者感染幽口螺桿菌后血清中會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，而且由于所感染的幽口螺桿菌類 型不同，因此所產(chǎn)生的抗體類型也不同。本發(fā)明采用免疫印跡法，將待檢樣品與本發(fā)明所述 轉(zhuǎn)印有經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳分離的幽口螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜反應(yīng)，待檢樣品中的 抗體就會(huì)與印跡膜中蛋白抗原結(jié)合，然后經(jīng)過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)出現(xiàn)顯色區(qū)帶，據(jù)此判斷出待 檢樣品中所含HP抗體類型，進(jìn)而對(duì)患者所感染的HP進(jìn)行分型。
[0011] 其中，本發(fā)明所述印跡膜的制備方法為取HP全菌體蛋白用樣品緩沖液稀釋，利用 SDS-聚丙稀酷胺凝膠梯度不連續(xù)電泳將各種蛋白組分按分子量大小分開(kāi)，然后利用濕轉(zhuǎn)法 將HP全菌體蛋白由凝膠層中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上即得。
[0012] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還括酶標(biāo)記抗體和酶底物。
[0013] 在本發(fā)明中，所述酶標(biāo)記抗體為酶標(biāo)記的抗人IgG抗體。
[0014] 作為優(yōu)選，所述酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磯酸酶。
[0015] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還包括洗漆液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)帶中的一 種或幾種。
[0016] 在本發(fā)明中，所述洗漆液為磯酸鹽緩沖液。
[0017] 在本發(fā)明中，所述陽(yáng)性對(duì)照為HP細(xì)胞毒素蛋白抗體、HP空泡毒素蛋白抗體和尿素 酶抗體的混合溶液。
[0018] 在本發(fā)明中，所述陰性對(duì)照為正常人HP抗體陰性血清。
[0019] 在本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)帶為標(biāo)示HP細(xì)胞毒、HP空泡毒和尿素酶蛋白距起始線的相 對(duì)位置的條帶。
[0020] 從上述的技術(shù)方案可W看出，本發(fā)明所述幽口螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒包括轉(zhuǎn)印 有經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳分離的幽口螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜。本發(fā)明采用免疫印跡法 檢測(cè)幽口螺桿菌感染者血清中包括致病因子細(xì)胞毒（CagA)、空泡毒（VacA)和尿素酶亞單 位A和B抗體等多種化抗體，依據(jù)HP抗體不同確定感染的HP是否產(chǎn)毒株，進(jìn)而判斷患者 所感染化菌株血清學(xué)類型，確定感染的HP是否產(chǎn)毒株，進(jìn)而根據(jù)不同類型HP與慢性胃炎， 消化性潰瘍和胃癌的關(guān)系，實(shí)施對(duì)HP更合理的根治方法，對(duì)臨床開(kāi)展HP針對(duì)性治療有重要 的指導(dǎo)意義。本發(fā)明所述試劑盒僅需要待檢者提供血清，屬于非侵入性檢查，患者依從性較 好，而且檢測(cè)快速，整個(gè)時(shí)間僅需2小時(shí)，樣品需求量小，僅需10微升被檢血清，特異性強(qiáng)， 敏感性高，適用范圍廣，便于在各級(jí)醫(yī)院、衛(wèi)生部口推廣使用。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1示本發(fā)明所述試劑盒標(biāo)準(zhǔn)帶示意圖；
[0022] 圖2示不同幽口螺桿菌感染型檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中1號(hào)膜為無(wú)效實(shí)驗(yàn)，2號(hào)膜為 陰性對(duì)照，3號(hào)膜為II型HP感染，4號(hào)膜為I型HP感染。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種幽口螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借 鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域 技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí) 施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品 進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0024] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0025] 一種幽口螺桿菌分型檢測(cè)的試劑盒，包括轉(zhuǎn)印有經(jīng)電泳分離的幽口螺桿菌全菌體 蛋白的印跡膜。
[0026] 患者感染幽口螺桿菌后血清中會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，而且由于所感染的幽口螺桿菌類 型不同，因此所產(chǎn)生的抗體類型也不同。本發(fā)明采用免疫印跡法，將待檢樣品與本發(fā)明所述 轉(zhuǎn)印有經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳分離的幽口螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜反應(yīng)，待檢樣品中的 抗體就會(huì)與印跡膜中蛋白抗原結(jié)合，然后經(jīng)過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)出現(xiàn)顯色區(qū)帶，據(jù)此判斷出待 檢樣品中所含HP抗體類型，進(jìn)而對(duì)患者所感染的HP進(jìn)行分型。如化gA抗體僅見(jiàn)于I型HP 感染，VacA抗體僅見(jiàn)于I型HP感染，化eA抗體I型HP感染和II型HP感染均可出現(xiàn)，化eB 抗體I型HP感染和II型HP感染均可出現(xiàn)。因此只要觀察印跡膜上是否存在化gA抗體或 VacA抗體即可對(duì)患者所感染的HP進(jìn)行分型。
[0027] 本發(fā)明所述印跡膜是幽口螺桿菌全菌體蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)印到固相支持物上。 [002引本發(fā)明所述幽口螺桿菌全菌體蛋白可W為幽口螺桿菌全菌的粗提物，也可W為幽 口螺桿菌全菌經(jīng)過(guò)一定的分離純化后的全菌蛋白。
[0029] 電泳分離通常是根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，如分子量、分子大小、電荷化及其等電點(diǎn)等 采用不同的電泳方法進(jìn)行分離。其中為了提高轉(zhuǎn)移的效率優(yōu)選為SDS-聚丙稀酷胺凝膠梯 度不連續(xù)電泳。不連續(xù)電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳。由于濃縮膠的堆積 作用，可使樣品（即使是稀樣品）在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定 濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進(jìn)行分離。由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續(xù) 電泳的分辨率大大高于連續(xù)電泳。
[0030] 其中，所述樣品緩沖液是一種W漠酪藍(lán)為染料，5倍濃縮的蛋白上樣緩沖液，常用 于常規(guī)的SDS-PAGE蛋白樣品的上樣。所述樣品緩沖液具體配置方法可參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手 冊(cè)》。
[0031] 經(jīng)電泳分離后的蛋白往往需要再利用電泳方法將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體載體 上。常用的轉(zhuǎn)移方法有半干轉(zhuǎn)法和濕轉(zhuǎn)法。半干轉(zhuǎn)法是凝膠和固體載體被夾在用緩沖液浸 濕的濾紙之間，通電時(shí)間為10分鐘?30分鐘。而濕轉(zhuǎn)法是凝膠和固體載體夾屯、浸放在轉(zhuǎn) 移緩沖液中，轉(zhuǎn)移時(shí)間可從45分鐘延長(zhǎng)到過(guò)夜進(jìn)行。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移方法為濕 轉(zhuǎn)法。
[0032] 轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的固相支持物可W為硝酸纖維素膜、PVDF膜或巧龍膜。硝酸纖維素膜 (Nitrocellulose Blotting Membranes，NC)是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對(duì)蛋白有 很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法。NC膜的使用也很簡(jiǎn)便，不需要甲醒預(yù)處理，很 容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可W穩(wěn) 定保存很長(zhǎng)時(shí)間。PVDF膜（Polyvin^idene-Fluoride，聚偏二氣己締）在蛋白質(zhì)截留能 力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更優(yōu)越的性能，而且PVDF膜更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性 使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測(cè)中成為理想選擇；而且單個(gè)凝膠的泳道復(fù)本可 用于多種目的。然而PVDF膜需要100%甲醇預(yù)處理（不超過(guò)15秒）再用緩沖液平衡。巧 龍膜更多是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見(jiàn)于蛋白印跡。巧龍膜結(jié)合力強(qiáng)，特結(jié)實(shí)又柔軟且不易卷 曲，機(jī)械強(qiáng)度大，便于操作，缺點(diǎn)是背景高、無(wú)法直接染色。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述固相支持 物為硝酸纖維素膜