一種乳腺癌檢測質(zhì)控品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種乳腺癌檢測質(zhì)控品及其制備方法，尤指一種用于肥R2基因擴(kuò)增 FISH檢測的質(zhì)控物及其制備方法，屬于臨床檢驗(yàn)學(xué)、病理學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。原癌基因 肥R2(人類表皮生長因子受體2基因）是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。有資料顯示，大約20-30% 的乳腺癌浸潤性導(dǎo)管癌中有肥R2基因的過表達(dá)。大量研究證實(shí)，肥R2基因擴(kuò)增不僅與乳 腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，而且對藥物治療方案的選擇也至關(guān)重要。
[0003] 肥R2陽性的乳腺癌對常規(guī)的化療和內(nèi)分泌治療反應(yīng)差，腫瘤浸潤性強(qiáng)，無病生存 期短，預(yù)后差。為此，多種阻斷肥R2的抗癌藥物相繼問世，其中曲妥珠單抗是一種重組DNA 衍生的人源化單克隆抗體，選擇性地作用于肥R2的細(xì)胞外部位，適用于治療肥R2過度表達(dá) 的乳腺癌。由于只有肥R2蛋白過度表達(dá)和基因擴(kuò)增的乳腺癌患者接受曲妥珠單抗治療才 有效，因此準(zhǔn)確評價(jià)肥R2基因和蛋白水平對治療至關(guān)重要。
[0004] 檢測肥R狀態(tài)的方法有；對于肥R2/neu共表達(dá)產(chǎn)生的蛋白水平的免疫組化，單拷 貝和雙拷貝的FISH (巧光原位雜交）、CISH(顯色原位雜交）W及SISH(銀增強(qiáng)原位雜交）。 對于肥R2基因擴(kuò)增的FI甜檢驗(yàn)是檢測肥R2狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)ASCO/CAP的指南標(biāo)準(zhǔn)，對 于免疫組化檢測積分為化的標(biāo)本，必須使用FI甜檢測進(jìn)行驗(yàn)證，W避免出現(xiàn)假陽性的可 能。然而對于該種方法來說，一個(gè)好的質(zhì)控品是保證檢測的準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。傳統(tǒng)上的質(zhì)控 品傾向于使用乳腺癌患者的組織樣本作為檢測質(zhì)控品，但是該種質(zhì)控品來源局限，一致性 較差，在應(yīng)用的過程中存在較大的局限性。此外，患者來源的質(zhì)控品只能隨機(jī)測定肥R2陽 性與陰性，無法特定地反映出肥R2基因表達(dá)水平W及多體造成的假陽性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種來源廣、易于獲得、一致性好的乳腺癌檢測 質(zhì)控品。
[0006] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供該種乳腺癌檢測質(zhì)控品的制備方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[000引一種乳腺癌檢測質(zhì)控品，是用乳腺癌細(xì)胞系通過福爾馬林固定，石蠟包埋，切片烤 片后制作成標(biāo)本切片。
[0009] 所述乳腺癌細(xì)胞系選自MCF-7細(xì)胞系、MDA-MB-453細(xì)胞系和S邸R-3細(xì)胞系中的 一種或幾種。
[0010] 本發(fā)明采用體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系制作的質(zhì)控品，可W替代真實(shí)組織樣本制 作的質(zhì)控品。我們研究了多種已經(jīng)公開的乳腺癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系SKBR3和 MDA-MB-453可W表達(dá)肥R2基因的擴(kuò)增，而細(xì)胞系BT-20、MBA-MD-175和MDA-MB-231則檢 測不到擴(kuò)增或者檢測量低。MCF-7是陰性細(xì)胞，其肥R2基因水平和正常人一致，基本為一 條染色體上有一個(gè)肥R2基因。發(fā)明人通過比較細(xì)胞系S邸R3和MCF-7，發(fā)現(xiàn)S邸R3細(xì)胞系 和MCF-7細(xì)胞系相比能表現(xiàn)幾乎10倍的基因擴(kuò)增W及15倍的肥R2蛋白的表達(dá)。發(fā)明人 對于使用的細(xì)胞系通過PCR方法驗(yàn)證肥R2基因水平，結(jié)果顯示本發(fā)明所選擇的細(xì)胞系能精 確地顯示肥R2基因水平的梯度變化。因此我們篩選出肥R2基因和肥R2蛋白表達(dá)水平存 在不同差異的特定細(xì)胞系，通過該些體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系制作質(zhì)控品，可W對肥R2基 因的不同表達(dá)水平做出區(qū)分。
[0011] 所述MCF-7細(xì)胞系還包括多體MCF-7細(xì)胞系。
[0012] 所述多體MCF-7細(xì)胞系是MCF-7細(xì)胞系經(jīng)秋水仙素處理得到。我們使用秋水仙素 處理MCF-7細(xì)胞系，使細(xì)胞分裂周期停留在分裂中期，造成細(xì)胞染色體形成2倍的現(xiàn)象，制 作乳腺癌細(xì)胞系假性多體的細(xì)胞系。由于在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞多為二倍體細(xì)胞，并不 能特異地選擇出多體細(xì)胞，該種方法得到的假性多體細(xì)胞彌補(bǔ)了該個(gè)缺點(diǎn)。
[0013] 所述的乳腺癌檢測質(zhì)控品，優(yōu)選是用培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞系、MDA-MB-453細(xì)胞系、 S邸R-3細(xì)胞系和多體MCF-7細(xì)胞系分別制作的標(biāo)本切片。也可W是多體MCF-7細(xì)胞系制作 的標(biāo)本切片與上述任意一種或多種細(xì)胞系制作的標(biāo)本切片的組合。該質(zhì)控品能夠模擬乳腺 癌病理組織的肥R2基因不同表達(dá)水平W及多體的情況。
[0014] 一種乳腺癌檢測質(zhì)控品的制備方法，包括W下步驟：
[0015] (1)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系；取乳腺癌細(xì)胞系體外培養(yǎng)至1〇7?108數(shù)量級并處于對數(shù) 生長期；
[0016] (2)制備多體細(xì)胞系：取MCF-7細(xì)胞系體外培養(yǎng)至1〇7?10 8數(shù)量級并處于對數(shù)生 長期，加入秋水仙素，培養(yǎng)2-4小時(shí)，形成多體MCF-7細(xì)胞系；
[0017] (3)制作質(zhì)控品切片；收集對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞系和多體MCF-7細(xì)胞系，經(jīng)過 固定、脫水、透明化處理、石蠟包埋、切片，制成質(zhì)控品切片。
[0018] 所述步驟（1)和（3)中的乳腺癌細(xì)胞系選自MCF-7細(xì)胞系、MDA-MB-453細(xì)胞系和 S邸R-3細(xì)胞系中的一種或幾種。
[0019] 所述步驟（3)的固定是指每種細(xì)胞分別加入15ml 10%中性甲醒固定細(xì)胞1小時(shí) 后lOOOr 5min離屯、，棄上清，加入1XPBS沖洗細(xì)胞3次。
[0020] 所述步驟做的脫水是指加入80%己醇15ml，靜置10min后 1500r5min離心棄 上清；加入90%己醇15ml，靜置lOmin后1500r 5min離屯、，棄上清；加入95%己醇15ml， 靜置lOmin后1500r 5min離心棄上清；加入無水己醇15ml，靜置15min后1500r 5min離 屯、，棄上清；加入無水己醇15ml，靜置15min后1500r 5min離屯、，棄上清。
[0021] 所述步驟（3)的透明化處理是指加入無水己醇和二甲苯的混合液（體積比 靜置 lOmin 1500r 5min 離屯、，棄上清；加入二甲苯 7ml 靜置 10min，1500r 5min 離 屯、，吸去6ml上清；吹打混勻?qū)⒓?xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1. 5ml EP管中，150化5min離屯、盡量吸干 凈上清；
[0022] 所述步驟（3)的石蠟包埋是指70°C融化石蠟，將融化的500ul液體石蠟分別加入 到每種細(xì)胞團(tuán)中，吹打混勻后，吸出到包埋盒（約500ul);再次灌蠟包埋；
[002引所述步驟（3)的切片是指4 ym/張切片，切片后于恒溫37°C水箱內(nèi)展片，用載玻片 撰片，驚干，置于70 °C溫箱烤片化。
[0024] 發(fā)明人對于得到的切片標(biāo)本通過金菩嘉、安必平公司試劑盒進(jìn)行檢測驗(yàn)證；對于 得到的切片標(biāo)本通過免疫組化的方法進(jìn)行檢測驗(yàn)證。FI甜實(shí)驗(yàn)和免疫組化結(jié)果分別從基因 和蛋白兩方面證明我們制作的質(zhì)控品達(dá)到了預(yù)期的陰陽性梯度和多體的目標(biāo)。
[0025] 本發(fā)明篩選得到了S種肥R2基因和肥R2蛋白表達(dá)水平存在不同差異的細(xì)胞系培 養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1〇7?1〇8/蠟塊，同時(shí)使用秋水仙素處理MCF-7細(xì)胞系，使細(xì)胞分裂周期 停留在分裂中期，造成細(xì)胞染色體形成2倍的現(xiàn)象，制作乳腺癌細(xì)胞系假性多體的細(xì)胞系。 之后將上述細(xì)胞系通過福爾馬林固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作乳腺癌細(xì) 胞系蠟塊，對蠟塊進(jìn)行4 y m切片，烤片，制作能用于肥R2基因擴(kuò)增FI甜檢驗(yàn)的質(zhì)控品。該 種通過細(xì)胞系制作的質(zhì)控品來源豐富，重復(fù)性和一致性高，同時(shí)能夠人為控制和選擇所需 的肥R2基因擴(kuò)增水平的質(zhì)控品，克服了傳統(tǒng)質(zhì)控品的不足。通過細(xì)胞系制作的質(zhì)控品操作 簡便，試驗(yàn)周期短，能夠大批量生產(chǎn)。本研究制作的質(zhì)控品能夠作為乳腺癌個(gè)體化檢測的質(zhì) 控品，用于室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC)和室間質(zhì)量評價(jià)巧QA)，并且具用較好的重復(fù)性和一致性。
[0026] 本發(fā)明的乳腺癌細(xì)胞系質(zhì)控品可W長期保存在大多數(shù)的溫度條件下，在室溫和 4°C環(huán)境保存兩周后檢測效果無變化。因此，我們得到的切片質(zhì)控品可W用于EQA和IQC，在 將切片質(zhì)控品作為EQA評估試驗(yàn)的質(zhì)控品發(fā)放的時(shí)候，它可W在室溫下無需冰袋進(jìn)行郵寄 并能長時(shí)間保存在-20°C或者-4°C條件下。
[0027] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明采用體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系制作的質(zhì)控品，可W作為 真實(shí)組織樣本制作的質(zhì)控品的替代品，樣本量大、重復(fù)性高，并且通過選擇不同細(xì)胞系可W 完成不同肥R2基因水平的檢測，制作方法簡便，能夠批量生產(chǎn)，易于保存，可用于室內(nèi)質(zhì)量 控制和室間質(zhì)量評價(jià)。
[002引下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，W便公眾對
【發(fā)明內(nèi)容】
有更 深入的了解，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換， 均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說明】
[0029] 圖1為S種細(xì)胞肥R2目的基因和內(nèi)參基因GAPDH同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR的 曲線圖，其中基線為綠色標(biāo)記線。
[0030] 圖2為細(xì)胞系制作切片的細(xì)胞分布示例情況，圖2上為10倍物鏡下觀察結(jié)果，圖 2下為40倍物鏡下觀察結(jié)果。
[0031] 圖3為安必平公司試劑盒檢測四種切片標(biāo)本的巧光示意