用于間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的無(wú)害化陽(yáng)性對(duì)照品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種用于間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的無(wú)害化陽(yáng)性對(duì)照品及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]間接法酶免診斷試劑是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。具體操作是將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。加酶標(biāo)抗抗體，使固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。最后加入底物顯色。
[0003]間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。間接法所采用的陽(yáng)性對(duì)照往往是該檢測(cè)試劑所測(cè)物種該類(lèi)抗原陽(yáng)性的血清加工后獲得的，有潛在生物危害。在試劑盒生產(chǎn)中陽(yáng)性對(duì)照采用人類(lèi)或動(dòng)物病原體感染后的陽(yáng)性血清經(jīng)滅活和稀釋而制成，這種血清只能來(lái)源于病毒感染者，由于需要保持抗體活性，不允許采用滅活效果好的高溫高壓或化學(xué)試劑滅活，所有在制備、運(yùn)輸和使用過(guò)程中存在生物安全問(wèn)題，不僅對(duì)直接接觸者和環(huán)境有風(fēng)險(xiǎn)，而且有人源或動(dòng)物源病原體感染、傳播、擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，大多數(shù)廠家的試劑盒說(shuō)明書(shū)均對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了強(qiáng)調(diào)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)病原體的無(wú)害化陽(yáng)性對(duì)照品及其制備方法與應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測(cè)病原體的無(wú)害化陽(yáng)性對(duì)照品，其特征在于，由鼠抗包被抗原的抗體和抗鼠IgG的抗體按1:32?2:1的摩爾比混合制成。優(yōu)選地，鼠抗包被抗原的抗體和抗鼠IgG的抗體按1:4的摩爾比混合制成。
[0006]所述包被抗原為待檢測(cè)病原體抗原。
[0007]本發(fā)明提供了制備用于檢測(cè)病原體的無(wú)害化陽(yáng)性對(duì)照品的方法，包括如下步驟:
[0008](I)制備鼠抗包被抗原抗體和抗鼠IgG抗體；⑵陽(yáng)性對(duì)照的獲得:取鼠抗包被抗原抗體和抗鼠IgG抗體混合并加入小牛血清和硫柳汞后用生理鹽水稀釋作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0009]其中，步驟(2)為取鼠抗包被抗原抗體和抗鼠IgG抗體按照摩爾比1:32?2:1混合，然后按照與抗體混合液的體積比10:1加入％的小牛血清，按照與抗體混合液的體積比2:1加入10%的硫柳汞后，用生理鹽水稀釋至總體積為抗體混合液的體積的200倍后作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0010]優(yōu)選地，步驟(2)中鼠抗包被抗原抗體和抗鼠IgG抗體按照摩爾比1:4混合。
[0011]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，取鼠抗包被抗原抗體Img和兔抗鼠IgG抗體4mg混合并加入50ml小牛血清和1ml 10%的硫柳汞后用生理鹽水稀釋至100ml作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0012]本發(fā)明的上述方法中，所述鼠抗包被抗原抗體為單抗，所述抗鼠IgG抗體為兔抗鼠IgG多抗。
[0013]所述鼠抗包被抗原的單抗或多抗是可與包被抗原反應(yīng)的基因表達(dá)、化學(xué)修飾、免疫學(xué)方法獲得的IgG類(lèi)抗體；所述抗鼠IgG的單抗或多抗是可與鼠IgG反應(yīng)的基因表達(dá)、化學(xué)修飾、免疫學(xué)方法獲得的抗體。
[0014]含有本發(fā)明陽(yáng)性對(duì)照品的檢測(cè)試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]進(jìn)一步地，所述檢測(cè)試劑盒為ELISA檢測(cè)試劑盒。
[0016]本發(fā)明還提供了上述陽(yáng)性對(duì)照品在無(wú)害化檢測(cè)病原體中的應(yīng)用。在應(yīng)用時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照品的濃度為0.05-20mg/mlo優(yōu)選地，陽(yáng)性對(duì)照品的濃度為0.5mg/ml。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:利用免疫學(xué)方法制備鼠抗包被抗原的單抗或多抗和兔抗鼠IgG的單抗或多抗，按照摩爾比1:32?2:1加入混合在一起作為陽(yáng)性對(duì)照，解決陽(yáng)性對(duì)照材料的來(lái)源受限的問(wèn)題，并避免使用含有病原的血清作為陽(yáng)性對(duì)照的潛在風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明采用嚴(yán)格檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行抗體制備從源頭上保障了生物安全性，這些來(lái)源與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體制成的陽(yáng)性對(duì)照不存在生物危害風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)，和從病毒感染者身體內(nèi)采集相比較來(lái)源更廣泛，抗體效價(jià)更高，完全可以滿足試劑盒中作為陽(yáng)性對(duì)照的需要。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0019]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0020]實(shí)施例1用于間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)病原體的無(wú)害化陽(yáng)性對(duì)照品的制備
[0021]1.鼠抗包被抗原單抗的獲得:以包被抗原作為免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，將免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相融合，然后用有限稀釋方法獲得可分泌紅細(xì)胞單抗的雜交瘤。具體步驟如下:
[0022]取0.2mg/ml的包被抗原，初次免疫采用皮下多點(diǎn)注射，0.1ml/點(diǎn)，共四點(diǎn)。2周后第二次免疫，劑量同上，腹腔注射。再2周后第三次免疫，劑量同上，腹腔注射(5?7天后采血測(cè)其效價(jià))。再過(guò)2?3周后加強(qiáng)免疫，劑量0.5ml，腹腔注射。最后一次加強(qiáng)免疫，劑量0.5ml，腹腔注射，3天后小鼠拉頸處死，無(wú)菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，將脾臟研碎，過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)，離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)，取I X 17脾淋巴細(xì)胞懸液備用，準(zhǔn)備融合。
[0023]將6?10周大的BALB/C小鼠拉頸處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3?5min，用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)皮膚，暴露腹膜，用無(wú)菌注射器注入5?6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液(嚴(yán)禁刺破腸管)反復(fù)沖洗，吸出沖洗液放入1ml離心管，1200rpm/分離5?6min，用20%小牛血清(NCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至I X 107/ml，加入96孔板，100 μ I/孔放入37°C CO2孵箱培養(yǎng)，制得飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0024]將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗I次，離心，1200rpm, 8min ;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的lml45%PEG (分子量400