復(fù)溶液為含有50%甲醇、1 %小牛血清炬SA)的磯酸鹽緩沖液。
[0161] 該試劑盒的使用方法為：
[0162] b-1)加樣；向羊抗兔抗抗體包被的酶標(biāo)板微孔中加入真菌毒素兔多克隆抗體工 作液lOOul/孔，用蓋板膜封板，20°C?39°C恒溫箱中反應(yīng)30?120min，倒出孔中液體，用 洗漆液b (250 y 1/孔）洗板4?5次，每次間隔10?30秒，用吸水紙拍干；
[0163] b-2)加抗體：每孔加入堿性磯酸醋酶標(biāo)記的真菌毒素抗原50 y 1，再分別加入標(biāo) 準(zhǔn)品0溶液b W及樣本溶液50 y 1/孔，用蓋板膜封板，20°C?39°C恒溫箱中反應(yīng)10? 30min ;
[0164] b-：3)倒出孔中液體，用洗漆液b (250 y 1/孔）洗板4?5次，每次間隔10?30 秒，用吸水紙拍干；
[01化]b-4)加顯色液：加入底物顯色液b 100 y 1/孔，輕輕振蕩混勻，20°C?39°C恒溫箱 避光顯色10?30min ;然后加入終止液b 50 y 1/孔，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸 光度值。
[0166] 本發(fā)明所述試劑盒中真菌毒素包被抗原是采用常規(guī)的化學(xué)偶聯(lián)方法將真菌毒素 半抗原與牛血清白蛋白炬SA)蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的，二抗可為羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗， 制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液的抑為值9. 6、0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被真 菌毒素抗原或二抗的載體物質(zhì)可為聚苯己締、纖維素、聚丙締酷胺、聚己締、聚丙締、交聯(lián)葡 聚糖、玻璃、娃橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可W是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片 等；所用的洗漆液為含有0. 1%?0.5%吐溫20,0. 5%疊氮化鋼（NaN3)防腐劑的磯酸鹽緩 沖液；所用的封閉液是含有8%?15%的脫脂奶和1 %惰性蛋白的溶液。
[0167] 本發(fā)明所述試劑盒中包被真菌毒素抗原的酶聯(lián)板或包被二抗的酶聯(lián)板的制備步 驟為：
[0168] (1)用包被緩沖液將真菌毒素半抗原與牛血清白蛋白炬SA)偶聯(lián)物或二抗W 0. 02?0. 08 y g/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或二抗稀釋液；
[0169] 似向酶聯(lián)板的每孔中加入100 y 1已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或二抗稀釋液，37°C 溫育化，傾去包被液，用洗漆液洗漆4次，每次15?30s，拍干；
[0170] 做向酶聯(lián)板的每孔中加入150?200 y 1封閉液，37°C溫育1?2h，傾去孔內(nèi)液 體，干燥后用侶膜真空密封保存。
[0171] W上方法制備的酶聯(lián)板具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)過冷熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，酶聯(lián)板的相關(guān) 技術(shù)參數(shù)均在正常范圍，且包被原有良好的特異性。
[0172] 本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記二抗或酶標(biāo)真菌毒素，所用酶可為過氧化 物酶或半乳糖甘酶，本發(fā)明優(yōu)選過氧化物酶；酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液； 酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋液含有50%甘油（可防止放入-20°C環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦 可長時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性）、1 %的疊氮化鋼防腐劑（便于保存）的溶液。
[0173] 本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記二抗（酶標(biāo)二抗）的制備步驟為：
[0174] (1)二抗的制備；W鼠源性抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠 二抗；或W兔源性抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔二抗。
[0175] (2)過氧化物酶標(biāo)記二抗的制備；首先在被偶聯(lián)的兩種分子中，與偶聯(lián)劑反應(yīng)較 弱的分子先用過量的偶聯(lián)劑活化，然后去除多余的偶聯(lián)劑；第二步將一端與某種分子連接 的偶聯(lián)劑，通過改變反應(yīng)條件而與另一種分子連接起來。二步法雖然操作較繁瑣，但偶聯(lián)效 率較高，而且形成的同分子聚合物減少。
[0176] 本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記抗原是采用活性醋法將標(biāo)記酶與真菌毒素半抗原進(jìn) 行偶聯(lián)得到。
[0177] 本發(fā)明所述試劑盒中真菌毒素特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體， 免疫原是采用活潑醋法將真菌毒素半抗原與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的；抗體形式可為 凍干粉、濃縮液、工作液；抗體稀釋液為pH值8. 2、0. 05mol/L、含有3%小牛血清的磯酸鹽緩 沖液。
[0178] 本發(fā)明所述試劑盒中真菌毒素特異性抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體，其制備 方法如下：
[0179] (1)真菌毒素單克隆抗體制備的步驟為：
[0180] a.動(dòng)物免疫程序：采用Ba化/c小鼠作為免疫動(dòng)物，免疫原（真菌毒素半抗原與牛 血清白蛋白的偶聯(lián)物）免疫劑量為80?100 y g/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐 劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2?3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完 全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞；
[0181] b.細(xì)胞融合與克隆化；取免疫Ba化/c小鼠脾細(xì)胞，按5?10 ;1比例與SP2/0骨 髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)化ISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對(duì)陽性 孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0182] C.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇；取處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1?5X106 個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存，復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C 水浴中速融，離屯、去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)；
[0183] d.單克隆抗體的制備與純化；采用體內(nèi)誘生法，將Ba化/c小鼠巧周齡）腹腔注入 滅菌石蠟油0. 5ml/只，7?14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5 X 105?106個(gè)/只，7?10天 后采集腹水，用辛酸-飽和硫酸錠法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20°C保存；
[0184] e.抗體凍干粉可將腹水在37°C環(huán)境下烘干，放入-20°C保存；
[01化]f.抗體工作液是用抗體稀釋液將抗體W 0. 02?0. 08 y g/ml濃度進(jìn)行稀釋。
[0186] (2)真菌毒素多克隆抗體制備的步驟為：
[0187] 采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，免疫原（真菌毒素與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物） 免疫劑量為Img/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下 多點(diǎn)注射，間隔3?4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一 次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7?10天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)， 屯、臟采血，經(jīng)硫酸錠分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
[0188] 本發(fā)明所述試劑盒中當(dāng)標(biāo)記酶為過氧化物酶時(shí)底物顯色液A液為過氧化氨或過 氧化脈、底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽或氨基水楊酸、終止液為0. 1?0. 5mol/L 的硫酸或鹽酸緩沖液。
[0189] 當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磯酸醋酶時(shí)；底物顯色液為對(duì)硝基磯酸鹽緩沖液；終止液為 2mol/L氨氧化鋼溶液；濃縮洗漆液為含有0. 8%吐溫20,0. 1%疊氮化鋼的磯酸鹽緩沖液； 濃縮復(fù)溶液為含有50%甲醇、1 %小牛血清炬SA)的磯酸鹽緩沖液。
[0190] 本發(fā)明所述試劑盒中真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液為不含真菌毒素的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品緩 沖液，緩沖液為含有1 %牛血清白蛋白的磯酸鹽緩沖液。
[0191] 實(shí)施例3
[0192] 本實(shí)施例提供了一種真菌毒素檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
[0193] 1.抗原的合成
[0194] a.包被原的合成
[01巧]將真菌毒素采用衍生物法合成真菌毒素半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和牛 血清白蛋白載體蛋白用活潑醋法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
[0196] b.免疫原的合成
[0197] 將真菌毒素采用常規(guī)化學(xué)合成法合成真菌毒素半抗原，再將半抗原通過重氮化反 應(yīng)和鑰孔械血藍(lán)蛋白載體蛋白用活潑醋法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
[019引 2.真菌毒素鼠單克隆抗體的制備
[0199] a.動(dòng)物免疫
[0200] 采用Ba化/c小鼠作為免疫動(dòng)物，W真菌毒素半抗原與鑰孔械血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為 免疫原，免疫劑量為300 y g/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑， 頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng) 免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
[0201] b.細(xì)胞融合和克隆化 悅0引取免疫Ba化/c小鼠脾細(xì)胞，按5 ;1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定 分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[020引 C.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
[0204] 取處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5X106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于 凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離屯、去除凍存 液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[02化]d.單克隆抗體的制備與純化
[0206] 采用體內(nèi)誘生法，將8周齡的Ba化/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后 腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5 X 106個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸錠法進(jìn)行腹水純 化，小瓶分裝，20°C保存。
[0207] 3.真菌毒素兔多克隆抗體的制備
[0208] 采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，W真菌毒素半抗原與鑰孔械血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為 免疫原，免疫劑量為3mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背 部皮下多點(diǎn)注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫 一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，屯、臟 采血，經(jīng)硫酸錠分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。