大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化ISA檢測(cè)方法領(lǐng)域，具體涉及大熊貓尿液中促黃體素的酶聯(lián)檢測(cè)方 法及其在大熊貓尿液組黃體素（LH)的檢測(cè)應(yīng)用，進(jìn)一步掌握大貓發(fā)情排卵及妊娠規(guī)律。
【背景技術(shù)】
[0002] 促黃體素（LH)是腦垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，由a和目?jī)蓚€(gè)亞基 組成，目亞基決定激素的特異抗原性和特異功能，但需與a亞基結(jié)合才具有生物學(xué)活性。 LH的產(chǎn)生受下丘腦促性激素釋放激素（GnRH)的控制，同時(shí)受卵巢的正反饋和負(fù)反饋調(diào)控。 目前，大量的研究表明，LH對(duì)卵泡發(fā)育成熟的完成和卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的獲得有重要作用。 卵泡由一個(gè)居于核也的卵細(xì)胞及周圍的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞組成。卵泡形成是一個(gè)高度 協(xié)調(diào)的生理過程，受多種因素調(diào)控。F甜和LH是調(diào)控卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素。雌激素的 產(chǎn)生依賴LH和FSH的協(xié)同作用，最后成熟和排卵都與LH密切相關(guān)。
[0003] 在人類中的研究表明：青春期前兒童促性腺激素處于低水平，青春期受下丘腦 GnRH的調(diào)控，F(xiàn)甜先于LH上升，青春期后期白天亦出現(xiàn)脈沖分泌，隨青春發(fā)育的成熟，LH分 泌逐漸增加，在生育年齡，F(xiàn)甜和LH的分泌隨月經(jīng)周期而出現(xiàn)周期性變化。F甜在卵泡早期 維持較低水平，隨卵泡發(fā)育至晚期，雌激素水平升高，F(xiàn)甜略下降，至排卵前24小時(shí)達(dá)最低， 隨即迅速升高，排卵后24小時(shí)又下降，黃體期維持低水平。LH在卵泡早期處于較低水平，W 后逐漸上升，至排卵前24小時(shí)左右達(dá)高峰，24小時(shí)后迅速下降，黃體后期逐漸下降。就卵泡 發(fā)育而言，F(xiàn)甜作用在早卵泡期，而LH作用在中、晚卵泡期，F(xiàn)甜和LH的協(xié)同作用促進(jìn)卵泡 發(fā)育和排卵，形成黃體并分泌孕激素。
[0004] 大熊貓是我國(guó)最稀有瀬危的物種之一，目前，野生和圈養(yǎng)種群數(shù)量不到2000只。 由于野生大熊貓棲息地及種群生存狀況持續(xù)惡化，提高圈養(yǎng)種群數(shù)量，在人工環(huán)境條件下 建立一個(gè)能自我維持的種群，是為我們?yōu)伵R滅絕的大熊貓的生存繁衍提供的最后保障。近 年來，為提高圈養(yǎng)種群數(shù)量，全國(guó)各大熊貓飼養(yǎng)單位協(xié)同攻關(guān)，在大熊貓圈養(yǎng)繁殖中遇到的 "配種難、受孕難、幼仔成活難"等難題上取得重大進(jìn)展，圈養(yǎng)環(huán)境下大熊貓幼仔成活率得W 大幅度提高，圈養(yǎng)種群規(guī)模不斷擴(kuò)大，目前圈養(yǎng)種群總數(shù)已達(dá)300多只，為W后圈養(yǎng)大熊貓 經(jīng)野化訓(xùn)練后放歸自然、復(fù)壯野生種群的個(gè)體來源奠定了基礎(chǔ)。
[0005] 但是，大熊貓人工繁殖難度大的現(xiàn)狀并未得到有效解決。大熊貓?jiān)谝荒曛兄挥幸?次排卵機(jī)會(huì)，并且對(duì)于雌性個(gè)體來講能接受自然交配的時(shí)間也非常短，最短的只有幾個(gè)小 時(shí)，如果在不恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)將雌雄個(gè)體配對(duì)進(jìn)行自然交配將會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物間激烈的打斗，引起 動(dòng)物的傷亡；而若采用人工授精，對(duì)人工授精時(shí)機(jī)的把握同樣非常重要，由于大熊貓人工授 精需要在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，已有的研究結(jié)果證明，若在排卵前對(duì)動(dòng)物實(shí)施麻醉，可導(dǎo)致排卵 抑制與延遲，而卵子維持授精能力的時(shí)間相對(duì)于精子而言要短得多，因此確定大熊貓確切 排卵與配種W及人工授精時(shí)機(jī)是大熊貓成功繁育的關(guān)鍵技術(shù)。由于大熊貓物種的特殊性， 無法獲得大熊貓各個(gè)時(shí)段的血液，適時(shí)監(jiān)測(cè)血清中的激素變化是不現(xiàn)實(shí)的。目前，對(duì)大熊貓 發(fā)情和排卵規(guī)律的認(rèn)識(shí)上，主要通過監(jiān)測(cè)發(fā)情期尿液中雌激素與孕激素水平變化情況W及 發(fā)情行為觀察加上經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行綜合判斷。但是，LH作為動(dòng)物誘發(fā)排卵的主要激素，對(duì)其精確 的變化規(guī)律的認(rèn)識(shí)是確定適時(shí)人工授精與適時(shí)自然交配指標(biāo)的有效手段。由于種屬差異的 原因，因缺乏特異的抗大熊貓LH抗體，無法建立大熊貓?zhí)禺惖腖H檢測(cè)方法，目前還沒有大 熊貓LH變化規(guī)律的研究報(bào)道。
[0006] 綜上所述，如何開發(fā)特異的抗大熊貓LH抗體，建立一種大熊貓尿液中LH激素代謝 產(chǎn)物的檢測(cè)方法，并通過此檢測(cè)方法進(jìn)一步掌握大熊貓發(fā)情排卵及妊娠規(guī)律，是一個(gè)亟待 解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明提供兩種特異的抗大熊貓促黃體素抗體，并利用該兩種 抗體制備大熊貓尿液促黃體素的檢測(cè)試劑盒，可W對(duì)大熊貓發(fā)情排卵及妊娠規(guī)律進(jìn)行監(jiān) 巧||，為大熊貓的人工授精或自然交配提供時(shí)間指導(dǎo)。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測(cè)方法，包括酶聯(lián)檢測(cè)方法中涉及的抗大熊貓 促黃體素抗體的制備方法，其特征在于，包括W下內(nèi)容：
[0009] (1)特異多膚片段的設(shè)計(jì)與合成：分別設(shè)計(jì)并合成大熊貓LH目亞基的兩條特異多 膚片段，記為L(zhǎng)H目-1和LH目-2 ;所述LH目-1的編碼序列是序列表中的SEQ ID No. 1，所述 LH目-2的編碼序列是序列表中的SEQ ID No. 2 ;將所述的LH目-1和LH目-2兩條多膚片段 分別與匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)，得到兩種偶聯(lián)免疫原，分別記為L(zhǎng)H目-KLH-1和LH目-KLH-2 ;
[0010] 似抗大熊貓促黃體素抗體的制備：將步驟（1)中所述的偶聯(lián)免疫原LH目-KLH-1 免疫兔，對(duì)免疫后的兔進(jìn)行也臟采血，并分離血得到血清，將得到的血清通過親和層析，分 步收集高濃度的純化產(chǎn)物，然后通過超濾離也管進(jìn)行濃縮，即得濃縮后第一種抗大熊貓促 黃體素抗體；同時(shí)，將步驟（1)中所述的偶聯(lián)免疫原LH目-KLH-2免疫兔，并進(jìn)行上述相同的 操作后，得到濃縮后第二種抗大熊貓促黃體素抗體。
[0011] 進(jìn)一步地，所述步驟（2)中將偶聯(lián)免疫原免疫兔包括W下內(nèi)容；首次免疫劑時(shí)，是 將500ug偶聯(lián)免疫原與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻后，對(duì)兔進(jìn)行注射免疫；兩周后進(jìn) 行第一次加強(qiáng)免疫，將250ug偶聯(lián)免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑混合均勻后，對(duì)兔進(jìn) 行注射免疫；一周后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，免疫劑量和方法與第一次加強(qiáng)免疫相同；待兔 耳緣靜脈血清效價(jià)達(dá)1:10000倍后，進(jìn)行第H次加強(qiáng)免疫，免疫劑量和方法與第一次加強(qiáng) 免疫相同。
[0012] 進(jìn)一步地，步驟（2)中所述的也臟采血是在第H次加強(qiáng)免疫3天后進(jìn)行。
[0013] 作為優(yōu)選，步驟（2)中所述的親和層析的填料為蛋白G瓊脂糖。
[0014] 一種大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測(cè)方法，包括酶聯(lián)檢測(cè)方法中涉及的大熊貓促 黃體素檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括W下內(nèi)容；上面所述的第一種抗大熊貓促黃體素抗體 包被的96孔酶標(biāo)板、生物素標(biāo)記的上面所述的第二種抗大熊貓促黃體素抗體、抗生素蛋白 鏈霉菌素-辣根過氧化物酶復(fù)合物、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品緩沖液、洗涂緩沖液、色原底物溶液和色 原終止液；
[0015] 所述的標(biāo)準(zhǔn)品為一條共計(jì)38個(gè)氨基酸的多膚片段，此多膚片段的編碼序列為序 列表中 SEQ ID No. 3。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的色原底物溶液為TMB顯色液；所述的色原終止液為濃度IM的硫 酸溶液。
[0017] 上面所述的大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測(cè)方法，在大熊貓尿液促黃體素檢測(cè)中 的應(yīng)用。
[001引本發(fā)明的有益效果如下：
[0019] 1.本發(fā)明提供抗大熊貓促黃體素抗體的制備方法，并將制得的兩種特異的抗體運(yùn) 用到大熊貓尿液促黃體素的檢測(cè)試劑盒中，可對(duì)大熊貓發(fā)情、排卵及妊娠規(guī)律進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為 大熊貓的人工授精或自然交配提供時(shí)間指導(dǎo)，解決大熊貓受孕難的問題。
[0020] 2.本發(fā)明利用大熊貓LH特異的抗體建立了大熊貓尿液中LH代謝產(chǎn)物的夾也式酶 聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，此檢測(cè)試劑盒靈敏度高，可達(dá)lOng/ml ;此檢測(cè)試劑盒重復(fù)性高，批內(nèi) 和批間誤差均小于10% ;此檢測(cè)試劑盒的準(zhǔn)確性高，其回收率可高達(dá)99. 5%。
【附圖說明】
[002。 圖1表示本發(fā)明中大熊貓LH檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0022] 圖2表示本發(fā)明中大熊貓LH檢測(cè)試劑盒的平行試驗(yàn)結(jié)果；
[002引圖3表示大熊貓發(fā)情期L