一種采用大豆過氧化物酶偶聯(lián)蛋白分子制備生物探針的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用大豆過氧化物酶偶聯(lián)蛋白分子制備生物探針的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆過氧化物酶(Soybean peroxidase, SBP)是以血紅素為輔基的III類過氧化物酶(EC 1.11.1.7)，SBP是一種由單一肽鏈與鐵卟啉構(gòu)成的血紅素蛋白，脫輔基蛋白分子與血紅素結(jié)合構(gòu)成全酶，含有大約分子量的18%的糖基，其等電點為3.9，在pH 3-8之間活性較高，作用范圍可達pH 2-11。辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)是一個陽離子酶，SBP和HRP同屬于植物過氧化物酶超家族的III類酶，兩者的結(jié)構(gòu)和作用機理有許多相似之處。有研宄表明，SBP的構(gòu)象穩(wěn)定性遠高于HRP，HRP的解鏈溫度為74°C (pH7.0)，遠低于 SBP 的 860C (pH 7.0)，SBP 的結(jié)合能為 43.3KJ/mol,而 HRP 只有 17KJ/mol，主要原因是SBP與HRP的血紅素鍵聯(lián)不同，特別是與血紅素相連的氨基酸活性位點不同。此外，SBP有更能暴露于溶劑的血紅素邊緣(血紅素邊緣是和底物相互作用的部位)使得SBP比HRP具有更高的催化活性。當(dāng)使用SBP代替常用的HRP制備生物探針催化魯米諾-過氧化氫反應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光檢測時，由于HRP是陽離子酶，會與氧化底物自由基產(chǎn)物相互作用而使酶失活，而SBP是陰離子酶，不會因為氧化反應(yīng)產(chǎn)物作用失活，會產(chǎn)生一個較長時間的化學(xué)發(fā)光信號。使用SBP代替常用的HRP作為標(biāo)記酶，在耐熱性能、底物作用范圍、酸堿穩(wěn)定性以及制備成本等多項指標(biāo)上均有明顯優(yōu)勢。
[0003]大豆過氧化物酶是從大豆加工副產(chǎn)物大豆皮中提取的一類具有很高活性的酸性同功酶，而大豆皮是制油廠大豆加工的副產(chǎn)物，原料價廉易得，能夠用于大批量生產(chǎn)。同時大豆過氧化物酶具有的底物作用范圍廣、耐熱性能高、酸堿穩(wěn)定性好、PH適用范圍寬等優(yōu)點是同類過氧化物酶不可比擬的，所以采用大豆過氧化物酶代替辣根過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶等過氧化物酶作為標(biāo)記酶用于生物探針制備具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種采用大豆過氧化物酶偶聯(lián)蛋白分子制備生物探針的方法，采用大豆過氧化物酶為標(biāo)記酶，解決了現(xiàn)有技術(shù)中HRP催化致使魯米諾氧化反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號持續(xù)時間短，發(fā)光信號不穩(wěn)定的問題。
[0005]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]一種采用大豆過氧化物酶偶聯(lián)蛋白分子制備生物探針的方法，包括如下步驟:
[0007]步驟一、利用氧化劑氧化大豆過氧化物酶中的糖苷鍵；
[0008]步驟二、將蛋白與步驟一得到的大豆過氧化物酶反應(yīng)形成希夫氏堿，形成穩(wěn)定的酶-蛋白分子；
[0009]步驟三、提純步驟二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探針。
[0010]步驟一所述氧化劑包括高碘酸鈉，所述高碘酸鈉在反應(yīng)溶液中的濃度為4 - 8mmoL0
[0011]步驟二所述蛋白為甲胎蛋白抗體、人絨毛膜促性腺激素β亞基抗體、游離雌三醇抗體、抑制素A抗體和鏈酶親和素。
[0012]本發(fā)明采用大豆過氧化物酶偶聯(lián)蛋白分子制備生物探針的方法，具體包括如下步驟:
[0013]步驟一、取5mg大豆過氧化物酶溶于500 yL PBS中，加入12mg/mL Na14溶液500 4 1^，混勻，置室溫避光反應(yīng)151^11 ;后加入500 μ L，0.1 - 5ν/ν%乙二醇室溫反應(yīng)30min ；利用Na14對大豆過氧化物酶進行氧化，氧化速度極為迅速，加入乙二醇及時阻止了氧化環(huán)境對酶活的繼續(xù)損傷，在一定程度上保持了酶活；
[0014]步驟二、將步驟一得到的溶液均分為五份，依次加入813 μ L、lmg/mL甲胎蛋白抗體(AFP抗體)，188 μ L、lmg/mL抑制素A抗體(InhibinA抗體)，200 μ L、lmg/mL人絨毛膜促性腺激素β亞基抗體(0-1?^抗體)，100^1^、11^/1^游離雌三醇抗體(uE3抗體)和100uL、5mg/mL鏈酶親和素混勾，裝入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸鹽緩沖液4°C透析24h，使大豆過氧化物酶和蛋白結(jié)合；向五種溶液中依次加入5mg/mL NaBH4溶液100 μ L，混勾，置4°C還原反應(yīng)2h ;利用NaBH4使碳氮雙鍵變成單鍵，從而形成穩(wěn)定的酶-蛋白分子；
[0015]步驟三、步驟二得到的五種溶液中分別加入和溶液等體積的飽和硫酸銨溶液，鹽析0.5h，1000rpm離心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，裝入透析袋，于PBS中4°C透析過夜，重復(fù)本步驟中鹽析至透析步驟兩次；次日取出離心，除去不溶物，上層清液為大豆過氧化物酶-蛋白結(jié)合物，每種溶液中分別加入PBS 500 yL復(fù)溶；效價測定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶保存。分別偶聯(lián)五種蛋白的生物探針可作為標(biāo)記抗體可以用于酶聯(lián)免疫吸附抗原的檢測。
[0016]本發(fā)明方法制備的生物探針?biāo)玫陌l(fā)光底物液為1.2mM 3-(1(^ -吩噻嗪基)丙基-1-磺酸鹽、0.6mM 4-馬琳吡啶、0.4mM魯米諾、0.4mM H2O2以及 50mM pH 8.5 的 Tris-HCL緩沖液組成的混合溶液。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
[0018]1、本發(fā)明使用大豆過氧化物酶代替現(xiàn)有技術(shù)中的HRP作為標(biāo)記酶制備生物探針，一方面此酶的熱穩(wěn)定性比HRP高，發(fā)光信號比HRP強，可以持續(xù)較長時間的強化學(xué)發(fā)光，檢測靈敏度能夠獲得大大提高。其次，本發(fā)明制備的五種生物探針，可用于多項蛋白的檢測，同時由于大豆過氧化物酶原料來源廣，價格低廉，其產(chǎn)業(yè)化研宄具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的意義。
[0019]2、本發(fā)明控制高碘酸鈉氧化的最佳濃度為4 - 8mmoL，制得的生物探針僅有5%左右的醛化酶(SBP — CH0)發(fā)生自身交聯(lián)，其結(jié)合率可以達到95%，酶活性可保留80 - 90%，制得的生物探針與傳統(tǒng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的生物探針相比較，具有更強的化學(xué)發(fā)光信號和更長的發(fā)光時間。
【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明方法反應(yīng)流程示意圖。
[0021]圖2是實施例2中HRP與SBP兩種生物探針發(fā)光穩(wěn)定性的比較。
[0022]圖3是實施例3中發(fā)光底物液中不加入和加入增強劑發(fā)光信號強度的比較。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做更進一步地解釋。下列實施例僅用于說明本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明的實施范圍。
[0024]以下實施例涉及的PBS為1mM pH 7.4，lv/v%乙二醇水溶液為含有二次水配制的lv/v%乙二醇水溶液；使用的大豆過氧化物酶購自美國B1-Research Products公司；AFP抗體、InhibinA抗體、β-HCG抗體、uE3抗體購自英國Abcam公司，鏈酶親和素購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0025]實施例1采用大豆過氧化物酶偶聯(lián)蛋白分子制備生物探針
[0026]一種采用大豆過氧化物酶偶聯(lián)蛋白分子制備生物探針，反應(yīng)流程如圖1所示，包括如下步驟:
[0027]1、取5mg大豆過氧化物酶溶于500 μ L PBS中，加入新配制的12mg/mL Na14溶液500 μ L，混勻，置室