一種檢測豬血清中偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的試紙卡及制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物病毒學與免疫學檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種用于檢測豬血清 中偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的免疫膠體金試試紙卡，同時還涉及一種用于檢測豬血清中 偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的免疫膠體金試試紙卡的制備方法，還涉及一種用于檢測豬血 清中偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的免疫膠體金試試紙卡的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬偽狂犬?。≒R)是由偽狂犬病病毒（PRV)引起的一種急性傳染病。感染豬的臨 床特征為體溫升高，新生仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀。成年豬常為隱性感染，妊娠母豬感染后可引起 流產(chǎn)、死胎及呼吸系統(tǒng)癥狀。本病廣泛分布于世界各國，在我國也廣泛存在，是重要的傳染 病之一，一旦發(fā)病，很難根除，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失，使生產(chǎn)效益極大的降低，嚴重制 約著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。被列為國家中長期動物疫病防治規(guī)劃中二類優(yōu)先防治的國內(nèi) 動物疫病。因此，該病的凈化和根除計劃分外重要。
[0003] PRV整個基因組大小約為150Kb，已被發(fā)現(xiàn)有11種糖蛋白，分別命名為gB、gC、gD、 gE、gG、gH、gl、TK、gL、gM和gN。目前國際廣泛應用的疫苗是gE基因與TK基因雙缺失疫 苗。將雙基因缺失疫苗注射動物后，動物不能產(chǎn)生缺失蛋白抗體。因此，可以通過檢測gE 蛋白抗體的有無來確定豬只是否感染偽狂犬病病毒野生毒株。
[0004] 在中國，豬偽狂犬病病毒gE基因缺失疫苗也正在廣泛應用，gE基因缺失疫苗免疫 接種后，在被免疫的豬血清中不能檢測到針對gE蛋白的抗體，為利用血清進行PRV野生 毒株感染豬和gE基因缺失疫苗免疫接種豬進行鑒別診斷提供了條件，這也是豬偽狂犬病 凈化和根除計劃的基礎(chǔ)。因此，在凈化和根除計劃中，監(jiān)測和檢測豬血清中的偽狂犬病病毒 gE蛋白抗體是非常重要的一個環(huán)節(jié)。對已經(jīng)免疫接種過的豬進行血清抗體檢測，如果檢測 到gE蛋白抗體，說明豬已經(jīng)感染了豬偽狂犬病病毒的野生毒株，可將感染的豬只淘汰，徹 底凈化和根除豬偽狂犬病。
[0005]目前國內(nèi)檢測豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體一般采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)， 但是由于這種檢測方法的特殊性，必須在實驗室中完成，所用時間長，費用高。因此建立一 種快速、方便、特異性高、靈敏度強、現(xiàn)場可用的檢測方法很有優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測豬血清中偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的試紙 卡，本試紙卡檢測快速，成本低廉，操作方便，靈敏度高；本發(fā)明的優(yōu)點是使用了不飽和標記 法標記豬偽狂犬病病毒gE蛋白單克隆抗體，提高了檢測的靈敏性和特異性。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種豬血清中偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的試 紙卡的制備方法，試紙卡制備過程簡單，原輔料廉價易得，試紙卡操作簡單，臨床使用中不 需要任何設(shè)備，便于攜帶和現(xiàn)場使用。
[0008] 本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種豬血清中偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的試 紙卡在檢測豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體中的應用，主要針對現(xiàn)有的豬血清中偽狂犬病病 毒gE蛋白抗體檢測方法操作繁瑣，檢測耗時耗力，還需專業(yè)人員操作的現(xiàn)象，此試紙卡操 作簡單，檢測快速、準確，結(jié)果易于判斷，無需專業(yè)人員及儀器操作，且可在養(yǎng)豬現(xiàn)場使用。
[0009] 為了實現(xiàn)以上的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種用于檢測豬血清中偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的試紙卡，試紙卡是由免疫膠體金 試紙條和卡體組成?？w包括支撐背板、檢測窗孔和加樣孔；免疫膠體金試紙條包括樣品 墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、底板，硝酸纖維膜上設(shè)有包被有豬偽狂犬病病毒鄂 A株的檢測線和包被有羊抗鼠 IgG質(zhì)控線。其連接關(guān)系是：硝酸纖維素膜粘貼在底板上面， 在硝酸纖維膜的一端粘貼有金標結(jié)合墊和樣品墊，吸水墊粘貼于硝酸纖維素膜的另一端； 樣品墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊相接處（1 一 3毫米)分別部分重合，檢測線與質(zhì) 控線相互平行，相距6~8mm，且與膠體金試紙條的長相垂直，檢測線靠近（1-2 mm)金標結(jié)合 墊一端，質(zhì)控線靠近（1-2 mm)吸水墊一端。免疫膠體金試紙條放置于卡體中，檢測線和質(zhì) 控線設(shè)置在檢測窗孔所對應的位置，加樣端與加樣孔位置相對應。
[0010] 所述的金標結(jié)合墊(購自上海杰一生物生物技術(shù)有限公司）為金顆粒標記豬偽狂 犬病病毒gE蛋白單克隆抗體； 所述的檢測線與質(zhì)控線分別包被有豬偽狂犬病病毒鄂A株和羊抗鼠 IgG。 toon] 所述的樣品墊與金標結(jié)合墊具體為緩沖液處理過的吸水紙和玻璃纖維，緩沖液的 配方為：含〇· 5% (w/v)牛血清白蛋白（BSA)，3% (w/v)鹿糖，0· 5% (v/v)吐溫-20的IOmmol/ L 的 PBS，PH8. 5。
[0012] 所述的豬偽狂犬病病毒gE蛋白單克隆抗體為2E6細胞所制。
[0013] 一種檢測豬血清中偽狂犬病病毒gE蛋白抗體的試紙卡的制備方法，其步驟是： A.制備并純化豬偽狂犬病病毒（PRV):將-78~-82°C保存的偽狂犬病病毒鄂A株(該 偽狂犬病病毒鄂A株來源見參考文獻：陳煥春等，豬偽狂犬病病毒鄂A株的分離鑒定，畜 牧獸醫(yī)學報，1998年02期）取出，感染單層的pK-15細胞(購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心， CCTCC，⑶C061，PK-15細胞的編號是⑶C061)，提取病毒DNA，經(jīng)PCR鑒定正確后，0. 5個MOI 接種pK-15細胞，出現(xiàn)90%細胞病變后收毒,將病毒液反復凍融2~4次,56°C滅活,將病毒 液8000rpm離心lOmin，棄掉沉淀，并將離心后的上清液放入潔凈的燒杯中，在磁力攪拌器 攪拌下，將硫酸銨按41. 5~43. 5g每IOOml的劑量緩慢加入燒杯中的病毒液中，攪拌過夜，低 溫高速12000rpm、4°C離心IOmin,棄掉上清，沉淀用1/5原體積的IOmM PH9. 0 Tris-HCL重 懸，用IOmM PH9.0 Tris-HCL為透析液，4°C透析22~26h，期間多次更換透析液，回收透析袋 中病毒液，27000rpm超高速離心lh，沉淀用1/5原體積的IOmM PH9. 0 Tris-HCL重懸，設(shè)置 四個蔗糖密度梯度分別為60% (w/v)、45% (w/v)、35% (w/v)、20% (w/v)進行梯度離心，收集 不同條帶的病毒后，脫糖，將不同線病毒用病毒保護劑重懸，檢測豬偽狂犬病病毒gE陽性， 最終確定用35%條帶病毒作為檢測線包被物。所述病毒保護劑為含有3%w/v鹿糖，0. 2%w/v 牛血清白蛋白的IOmM PH7. 2 PBS溶液。
[0014] B.制備金標結(jié)合墊，其制備方法如下： (1)所述的豬偽狂犬病病毒gE蛋白單克隆抗體是由雜交瘤細胞2E6分泌的，雜交瘤 細胞2E6制備方法為：采用雜交瘤細胞技術(shù)(參見文獻：沈關(guān)心、周汝麟，現(xiàn)代免疫學實驗技 術(shù)，武漢：湖北科學技術(shù)出版社，1998)，用純化的豬偽狂犬病病毒鄂A株免疫BALB/c小鼠， 取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，用HAT選擇性培養(yǎng)基(購自SIGM公司）進行培養(yǎng) 后，再用豬偽狂犬病病毒鄂A株和偽狂犬病病毒gE/gl基因缺失株(參見中國發(fā)明專利申請 公開說明書，申請專利號200510019513. 8)進行間接免疫熒光篩選，篩選后的陽性細胞