一種基于氣壓檢測靶標(biāo)的定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于氣壓檢測的定量分析方法，用于無機離子、小分子、生物大分 子特別是蛋白質(zhì)、DNA、甚至病毒、細(xì)菌、細(xì)胞等多種靶標(biāo)的高靈敏度定量。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)展新穎、靈敏、高選擇性、廉價、方便的定量檢測分析方法一直是科研工作中最 為熱門的課題。現(xiàn)有的定量檢測分析方法通常都依賴于各種大型精密儀器，例如光譜儀、質(zhì) 譜儀、色譜儀、電泳等。在這些定量分析方法經(jīng)過長時間的發(fā)展，已經(jīng)建立起成熟的檢測方 法和技術(shù)，因而被廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品等總多領(lǐng)域的樣品檢測和分析中，例如 各種有機小分子、生物大分子乃至細(xì)菌、病毒、細(xì)胞等。然而，無論是質(zhì)譜、色譜、電泳，或是 光學(xué)分析儀器，要實現(xiàn)高靈敏的定量檢測和分析，對儀器的精密程度和對檢測部件的靈敏 度都有很高的要求，以致使得檢測儀器和檢測實驗的成本一直難以降低。
[0003] 以基于光學(xué)的定量分析儀器為例，常見的如紫外-可見分光光度計、紫外譜儀、熒 光儀等。為了實現(xiàn)高靈敏度的精確定量檢測分析，這些儀器不僅需要提供復(fù)雜而精密的 光路部件，例如光柵、濾鏡、透鏡組，還需要經(jīng)過良好培訓(xùn)的操作人員對儀器進(jìn)行精確的調(diào) 控。除此之外，為了提高儀器的靈敏度，還需要提供高功率的光源來實現(xiàn)光學(xué)信號的富集 和增益。同時，基于光學(xué)的檢測方法對檢測體系有極高的要求。一方面，檢測體系的成分 不能過于復(fù)雜，當(dāng)靶標(biāo)之外的分子或物質(zhì)具有與檢測靶標(biāo)分子近似的光學(xué)特性時，都會嚴(yán) 重影響檢測的準(zhǔn)確度，因而光學(xué)檢測體系通常需要復(fù)雜的前處理步驟以避免該問題；另一 方面，并非所有的分子都具有良好的光學(xué)特性，因而通常會使用分子識別技術(shù)對分子進(jìn)行 標(biāo)記和信號放大，例如酶聯(lián)免疫法，即利用免疫學(xué)方法將能夠催化生產(chǎn)一定熒光特性或光 學(xué)吸收特性的產(chǎn)物，來實現(xiàn)對革E標(biāo)抗原的檢測（l、Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemist ry[J]，1971，8(9) :871-874.)。上述問題都使得光學(xué)定量檢測分析方法的成本都難以進(jìn)一步 降低。因此，如何開發(fā)一種廉價可行的但又具有良好靈敏度的定量檢測方法日益受到研宄 人員的關(guān)注。
[0004] 與此同時，隨著科技的發(fā)展，以及對科學(xué)和生命本質(zhì)認(rèn)知的提高，人們已經(jīng)不再滿 足于實驗室中昂貴而又耗時的實驗檢測，他們更加迫切的希望科技能與生活中的應(yīng)用相結(jié) 合，真正實現(xiàn)"科技改變生活"。例如"即時診斷"的概念日益受到關(guān)注（2、R. J.Davies，S. S.E. , S. J. Carlisle, Handbook of Biosensors and Biochips,Wiley, Hoboken[M]. 2008.； Liu, H. , Xiang, Y. , Lu, Y. , Crooks, R. M. , Aptamer-based origami paper analytical device for electrochemical detection of adenosine,Angewandte Chemie-International Edition [J]·2012, 51. 6925-8. ；4> Liu,J. ff. , Oligonucleotide functionalized hydrogels as stimuli responsive materials and biosensors, Soft Matter[J]· 2011, 7. 6757-6767·)。所謂即時診斷（Point of Care Test，POC Test)，是指 在發(fā)病或者發(fā)生事件的地點進(jìn)行即時檢測和診斷，從而實現(xiàn)迅速的監(jiān)控和治療?，F(xiàn)代的POC 檢測方法通常利用免疫分析技術(shù)，即特異性抗體會與抗原相結(jié)合，來捕捉目標(biāo)物進(jìn)行分析。 以疾病特異性目標(biāo)蛋白標(biāo)記物作為檢測目標(biāo)，實現(xiàn)對疾病的診斷，如妊娠測試試劑盒以妊 娠激素人絨毛膜促性腺激素（hCG)為靶標(biāo)。然而，失去了精密儀器的支持，POC檢測的靈敏 度勢必會受到影響?，F(xiàn)有的POC檢測一般只能實現(xiàn)定性或半定量檢測，以致無法實現(xiàn)對疾 病或身體狀況的精確診斷。所以盡管POC檢測在即時診斷和緊急情況應(yīng)對上能夠提供一定 的信息，但卻無法為更為快速的臨床治療提供更為準(zhǔn)確的依據(jù)。建立一種小型化，同時又具 有高靈敏度的快速廉價的檢測方法迫在眉睫。
[0005] 綜上所述，在未來的科學(xué)研宄中，如何發(fā)展一種既不影響實驗方法高靈敏度、高選 擇性、高準(zhǔn)確性等優(yōu)點，又能顯著降低檢測儀器和實驗成本，既能實現(xiàn)實驗室中高靈敏、高 準(zhǔn)確性的實驗要求，又能具有微型化、便攜低能耗等優(yōu)點，可應(yīng)用于即時診斷的的定量檢測 分析方法是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有高靈敏定量檢測分析方法及其儀器設(shè)備價格昂貴、實驗方法成本 高等缺點，發(fā)展了一種基于氣壓檢測的高靈敏度、高選擇性、高準(zhǔn)確性同時廉價便攜的定量 檢測分析方法，即可用于實驗室中高靈敏度、高選擇性的無機離子、小分子、生物大分子例 如蛋白質(zhì)、DNA、甚至病毒、細(xì)菌、細(xì)胞等多種靶標(biāo)的高靈敏度定量，又能用于快速的高靈敏 度POC定量檢測分析。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種基于氣壓檢測靶標(biāo)的高靈敏、通用的定量檢測方法，是在密閉體系中，利用分 子識別引入信號放大分子如酶或納米粒子，通過信號放大分子或粒子催化底物釋放出大量 氣體分子，導(dǎo)致體系氣壓增強，利用體系的壓強變化實現(xiàn)靶標(biāo)濃度的高靈敏定量檢測。
[0009] 其中，所述的分子識別技術(shù)為，利用如抗體、核酸適配體、核酸探針等具有特異性 識別功能的分子對靶標(biāo)進(jìn)行識別或標(biāo)記，并通過將這些識別分子將信號放大分子或粒子引 入檢測體系中。
[0010] 其中，利用分子識別技術(shù)對靶標(biāo)進(jìn)行識別或標(biāo)記，靶標(biāo)包括但不局限于蛋白、核 酸、肽鏈、糖類、脂類、有機小分子、無機離子、細(xì)胞、細(xì)菌、病毒。
[0011] 其中，信號放大分子包括過氧化氫酶、金納米粒子、鉑納米粒子、金鉑納米粒子、錳 氧化物納米粒子或其他可以催化底物產(chǎn)生氣體的催化劑或酶，其催化底物為受催化后可產(chǎn) 生大量氣體分子的物質(zhì)（如H 2O2)，氣體分子為底物受催化后的產(chǎn)物（如02)。
[0012] 其中，在密閉體系中，其反應(yīng)檢測體系包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)體系、DNA水 凝膠體系、功能化DNA傳感體系中的至少一種。
[0013] 在酶聯(lián)免疫吸附法體系中，基于氣壓檢測靶標(biāo)的定量分析方法優(yōu)選包括如下步 驟：（1)根據(jù)要檢測的抗原選擇相對應(yīng)的捕獲抗體及檢測抗體；（2)對信號放大分子進(jìn)行 修飾，使其與檢測抗體分子偶聯(lián)結(jié)合，或使其能夠特異性的與檢測抗體結(jié)合；（3)在多孔板 (例如96孔板）或磁珠或微球等能夠用于酶聯(lián)免疫吸附法的固相表面進(jìn)行包被，加入捕獲 抗體使其結(jié)合于包被后的固相表面，之后進(jìn)行封閉液封閉，加入待檢測抗原，再加入檢測抗 體，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)，洗去多余檢測抗體；(4)引入信號放大分子；（5)在多孔板中加入底 物，密封反應(yīng)腔體，信號放大分子催化底物分子，生成大量氣體分子，產(chǎn)生可由氣壓計讀取 的壓強變化信號；(6)根據(jù)氣壓計顯示的壓強變化數(shù)值，實現(xiàn)靶標(biāo)分子的高靈敏定量檢測。
[0014] 其中，可以利用多孔板表面為捕獲抗體吸附的固相表面，用于靶標(biāo)分子的捕獲；也 可以使用磁珠或微球作為捕獲抗體吸附的固相表面，通過磁場或離心等方法來實現(xiàn)靶標(biāo)分 子的捕獲。
[0015] 其中，引入信號放大分子或納米粒子的方法可以直接通過對檢測抗體進(jìn)行偶聯(lián)標(biāo) 記，也可以通過將特異性識別檢測抗體的分子修飾于信號放大分子或納米粒子，在檢測抗 體與靶標(biāo)分子結(jié)合后，再將信號放大分子或納米粒子與檢測抗體結(jié)合，使得信號放大分子 或納米粒子具有更好的通用性和適用性。
[0016] 在DNA水凝膠體系中，基于氣壓檢測的多種靶標(biāo)的即時可視化定量分析方法優(yōu)選 包括如下步驟：（1)將兩條丙烯酰胺/DNA高聚鏈、一條核酸適體分子與酶分子或納米粒子 混合，制備核酸適體交聯(lián)水凝膠；（2)將含有不同已知濃度分析物的溶液加入上述水凝膠 中反應(yīng)，釋放出酶或納米粒子；（3)反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)上清液，置于反應(yīng)試管中，使酶或納 米粒子與底物發(fā)生催化反應(yīng)；密閉體系中，產(chǎn)生的大量氣體使體系內(nèi)的壓強升高，利用氣壓 計進(jìn)行讀數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)，進(jìn)而可建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而檢測未知樣品中靶標(biāo)含量。
[0017] 其中，利用兩條丙烯酰胺/DNA高聚鏈，一條兩端能夠分別與兩條高聚鏈上DNA序 列互補配對的核酸適配體形成DNA水凝膠。
[0018] 其中，將酶分子或納米離子包裹在形成的DNA水凝膠中DNA三鏈結(jié)構(gòu)形成的腔體 中，利用分子之間的位阻限制酶分子或納米離子使其不能夠自由擴(kuò)散。靶標(biāo)分子存在時，核 酸適配體發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致DNA水凝膠瓦解，釋放出其中的酶分子或納米粒子。
[0019] 在功能化DNA傳感體系中，基于氣壓檢測的多種靶標(biāo)的即時可視化定量分析方 法優(yōu)選包括如下步驟：（1)針對靶標(biāo)分子選擇合適的核酸適配體，在核酸適配體一段添加 上與捕獲探針互補的序列；（2)根據(jù)核酸適配體的序列設(shè)計合適的檢測探針序列，使得無 靶標(biāo)分子存在時檢測探針能夠通過堿基之間的相互作用結(jié)合于核酸適配體鏈上，當(dāng)靶標(biāo) 分子存在時，能夠競爭下檢測探針；(3)利用生物或化學(xué)的偶聯(lián)方法，例如脫羧反應(yīng)或生物 素-親和素相互作用將捕獲探針連接在磁珠表面，加入檢測DNA以及核酸適體，使其在磁珠 表面形