一種針對(duì)多靶標(biāo)的即時(shí)定性分析方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種針對(duì)可卡因，腺苷，Pb2+等多種靶標(biāo)的即時(shí)可視化定性分析方法，屬于可視化定性分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]水凝膠是一類(lèi)親水性的高分子聚合物，能夠在水環(huán)境下發(fā)生溶脹，依靠物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)兩種方式生成。凝膠結(jié)構(gòu)能夠響應(yīng)多種環(huán)境參數(shù)，如溫度，PH，離子強(qiáng)度和溶劑組成等，而發(fā)生改變，因而也被稱(chēng)作"智能水凝膠"?；诟鞣N傳統(tǒng)意義上的水凝膠構(gòu)建的傳感器在響應(yīng)各種外界信號(hào)并發(fā)生性質(zhì)改變后，通常還要結(jié)合一些復(fù)雜、精密的儀器對(duì)特征變化進(jìn)行表征和記錄，這樣往往耗時(shí)費(fèi)力，不適合普及。DNA交聯(lián)水凝膠的出現(xiàn)，極大地?cái)U(kuò)展了水凝膠傳感器的應(yīng)用范圍（1、LiuJ，LiuH，KangH，et.al.，Aptamer-incorporatedhydrogelsforvisualdetection，controlleddrugrelease,andtargetedcancertherapy[J].AnalBioanalChem(2012)402:187-194.)〇[0003]核酸適體作為一類(lèi)新型的分析、診斷分子，自出現(xiàn)以來(lái)，受到科研工作者的廣泛關(guān)注。因其優(yōu)于傳統(tǒng)蛋白單克隆抗體的諸多特性，核酸適體已成為新興的研宄工具，在科研、疾病診斷和治療試劑等方面逐步取代傳統(tǒng)的抗體類(lèi)診斷和生物技術(shù)產(chǎn)品（2、GoldL，PoliskyB.,Uhlenbeck0.,et.al.,Diversityofoligonucleotidefunctions,AnnualReviewofBiochemistry[J]·1995,64.763-797;3、JayasenaS.，Aptamers:Anemergingclassofmoleculesthatrivalantibodiesindiagnostics,ClinicalChemistry[J].1999,45.1628-1650；4>WilsonD.,SzostakJ.,Invitroselectionoffunctionalnucleicacids,AnnualReviewofBiochemistry[J].1999,68.611-647；5>JoyceG.,In-vitroevolutionofnucleic-acids,CurrentOpinioninStructuralBiology[J].1994,4.331-336.)。核酸適體是指從人工合成的DNA/RNA庫(kù)中篩選得到的能夠與靶標(biāo)分子結(jié)合的單鏈寡核苷酸。核酸適體技術(shù)存在的基礎(chǔ)是核酸適體借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間作用力形成的特殊的三維結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體等（6、Li,F.，Zhang,J.，Cao,X.N.，Wang,L.H.，Li,D.，Song,S.P.，Ye,B.C.，F(xiàn)an,C.Η.,Adenosinedetectionbyusinggoldnanoparticlesanddesignedaptamersequences，Analyst[J].2009,134.1355-1360.)。另一方面，核酸適體的特異性很高，如茶堿與其RNA核酸適體的親和力相當(dāng)于其類(lèi)似物如咖啡因（與茶堿只相差一個(gè)堿基）的10,〇〇〇倍（7、Kato,T.,Takemura,T.,Yano,K.,Ikebukuro,K.,Karube,I.,InvitroselectionofDNAaptamerswhichbindtocholicacid,BiochimicaEtBiophysicaActa-GeneStructureandExpression[J]·2000,1493.12-18.)，還可以將氨基酸、腺苷等生物小分子的突變體、異構(gòu)體區(qū)分開(kāi)來(lái)。核酸適體技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用對(duì)象相當(dāng)廣泛，涵蓋了離子、小分子、生物大分子以及細(xì)胞。應(yīng)用目的則相對(duì)專(zhuān)一，主要是檢測(cè)和分析。[0004]與此同時(shí)，遺傳變異、疾病診斷、治療等與人類(lèi)健康息息相關(guān)的問(wèn)題受到越來(lái)越廣泛的重視。致力于解決上述問(wèn)題的生物小分子、生物大分子、細(xì)胞，特別是癌變細(xì)胞等的檢測(cè)，也因此成為化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)。其中基于核酸適體的放大技術(shù)憑借其高分析靈敏度，在超痕量核酸序列檢測(cè)中大放異彩，向著普及化、便攜化、低污染等方向發(fā)展。目前有代表性的涉及核酸相關(guān)酶的分子生物學(xué)信號(hào)放大研宄方向有以下幾種：基于飛速發(fā)展的納米生物技術(shù)的DNA的可視化檢測(cè)、癌癥檢測(cè)等；應(yīng)免疫學(xué)和癌癥生物學(xué)發(fā)展要求涌現(xiàn)的新型診斷和治療工具以及靈敏的系統(tǒng)監(jiān)測(cè)技術(shù)；更有利于生物分析及臨床診斷的對(duì)實(shí)際樣品中小分子及蛋白質(zhì)的檢測(cè)；與基于核酸適體的免疫磁分離相結(jié)合的血液、血漿等各種體液中存在的疾病標(biāo)志物的檢測(cè)；多態(tài)效應(yīng)的評(píng)估；應(yīng)用于酶活性的表征的核酸放大技術(shù)、miRNA的定量分析及治療研宄；新的DNAzyme。[0005]即時(shí)診斷是近年來(lái)日漸成熟的一項(xiàng)診斷技術(shù)。所謂即時(shí)診斷（PointofCareTest，POCTest)，是指在病人身旁迅速獲得檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)方便、快捷，不依賴(lài)昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備或者專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，亦不需借助復(fù)雜的樣品處理步驟，依靠簡(jiǎn)單的設(shè)備讀出信號(hào)或者通過(guò)觀測(cè)試紙上條紋、斑點(diǎn)等的顏色變化來(lái)反映檢測(cè)結(jié)果。除應(yīng)用于醫(yī)院、診所中迅速獲取病人信息外，即時(shí)診斷使疫情早期預(yù)警、家庭保健防護(hù)、貧困地區(qū)醫(yī)療乃至食物、水、環(huán)境等的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)等成為可能。[0006]紙芯片（MicrofluidicPaper-basedAnalyticalDevices，μPADs)是微流控芯片中最新發(fā)展的領(lǐng)域，由Whitesides組（8、Martinez,A.W.，Phillips,S.T.,Butte,M.J.,Whitesides,G.M.,PatternedPaperasaPlatformforInexpensive,Low-Volume,PortableBioassaysjAngewandteChemieInternationalEdition[J]，2007,46,1318-1320)在2007年首次提出。紙芯片是以紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，在紙的表面加工出具有一定結(jié)構(gòu)的微流體通道的微型分析器件，結(jié)合了微流控技術(shù)和紙的優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的微流控芯片相比，紙芯片的優(yōu)勢(shì)是：（1)紙來(lái)源豐富，可進(jìn)行批量生產(chǎn)；（2)不需要外接泵，紙的主要成分是纖維素，流體在紙上通過(guò)毛細(xì)作用流動(dòng)；(3)試樣消耗量更低；(4)檢測(cè)背景低，有利于光度法檢測(cè)；(5)生物兼容性好，可通過(guò)化學(xué)修飾改變紙的性質(zhì)；(6)-次性便攜式分析，操作簡(jiǎn)便，甚至不需要專(zhuān)業(yè)的操作人員。紙芯片為臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及食品安全分析中需要的便攜式檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)廣闊的平臺(tái)。此外，對(duì)于醫(yī)護(hù)人員和醫(yī)療設(shè)備緊缺的欠發(fā)達(dá)地區(qū)，紙芯片是低成本、檢測(cè)迅速的即時(shí)診斷。【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有儀器手段復(fù)雜、價(jià)格昂貴等問(wèn)題，提出一種快速、廉價(jià)、特異性分析復(fù)雜體系中多靶標(biāo)的可視化定性分析方法。[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案為：[0009]一種針對(duì)多靶標(biāo)的即時(shí)定性分析方法，包括如下步驟：[0010](1)根據(jù)靶標(biāo)選擇合適的核酸適體，并合成一可和核酸適體的第一部分序列互補(bǔ)的至少一鏈A，以及和核酸適體的第二部分序列互補(bǔ)的至少一鏈B;在鏈A、鏈B上分別修飾水凝膠單體；[0011](2)將修飾單體的鏈A、鏈B聚合形成線狀高分子聚合產(chǎn)物PS-A、PS-B;[0012](3)將多靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的PS-A、PS-B、包含有核酸適體的linker鏈和食用色素染料填充進(jìn)各分路紙芯片親水通道中，塑封成3D紙芯片；[0013](4)把多靶標(biāo)樣品加入3D紙芯片，靶標(biāo)刺激對(duì)應(yīng)的水凝膠瓦解從而保持樣品溶液的流動(dòng)；[0014](5)樣品溶液在毛細(xì)作用的推動(dòng)下流動(dòng)并與食用色素混合形成有色溶液，最終致使紙芯片信號(hào)響應(yīng)區(qū)染色，即可判斷對(duì)應(yīng)信號(hào)分子的存在；[0015](6)根據(jù)紙芯片響應(yīng)區(qū)的顏色，記錄檢測(cè)結(jié)果。[0016]其中，步驟（2)中，水凝膠中Linker鏈，鏈A和鏈B的終濃度分別為100μM-lmM。[0017]其中，步驟（4)在緩沖液中進(jìn)行，使用的緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液或Tris-CH3COOH緩沖液。[0018]其中，3D紙芯片包括順次接觸的至少五個(gè)區(qū)，儲(chǔ)樣區(qū)、linker-apt填充區(qū)、PS-A和PS-B填充區(qū)、食用色素填充區(qū)和流動(dòng)區(qū)。[0019]其中，3D紙芯片上設(shè)至少兩個(gè)用于檢測(cè)不同靶標(biāo)的通道。[0020]其中，不同通道之間設(shè)置顏色不同的色素。[0021]前述的針對(duì)多靶標(biāo)的即時(shí)定性分析方法，用于可卡因，腺苷和Pb2+的多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，包括如下步驟：（1)將多靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的兩條丙烯酰胺/DNA高聚鏈、一條核酸適體分子和食用色素分別填充進(jìn)紙芯片親水通道中，塑封成3D紙芯片；（2)將含有不同已知濃度混合的分析物溶液加入3D紙芯片中，反應(yīng)6min讀取不同顏色的響應(yīng)信號(hào)；（3)利用3D紙芯片響應(yīng)區(qū)信號(hào)顏色的差異，得到對(duì)響應(yīng)分析物的定性判斷；[0022]在步驟（1)中采用修飾有丙烯酸亞磷酰胺單體的DNA和丙烯酰胺的自由基聚合反應(yīng)制備聚合物鏈。[0023]優(yōu)選方法如下：[0024](1)合成丙烯酸亞磷酰胺單體[0025](2)甲基丙烯基團(tuán)修飾的核酸分子的合成與純化[0026]以普通CPG作為固相載體，以DNA單體堿基為原料，在DNA合成儀上由:T端向5'端合成鏈A、鏈B及l(fā)inker核酸適體，最后在兩條鏈A和B的5'端修飾上前節(jié)中合成的丙烯酸亞磷酰胺單體。具體合成的序列見(jiàn)表1;合成結(jié)束后，將上述CPG轉(zhuǎn)移至2mL潔凈滅菌的Eppendorf管中，加入0·5m當(dāng)前第1頁(yè)1 2