一種人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染快速檢測方法及用于該檢測方法的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬抗體工程和診斷方法領(lǐng)域，尤其涉及一種人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染快速 檢測方法及用于該檢測方法的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV)在人群中的感染極為普遍，呈世界 性分布，中國約90 %成人可檢出HCMV抗體。HCMV-旦感染將終身潛伏于宿主機(jī)體中，在 免疫功能正常的人群病毒與宿主處于"平衡"狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體由于各種原因?qū)е旅庖吡Φ拖聲r(shí) (HIV感染、移植和衰老等），這種"平衡"就會(huì)被打破引起HCMV再激活感染，引起再激活感 染的病毒可以來自宿主本身也可以來源于其他感染者。原發(fā)感染和再激活感染統(tǒng)稱活動(dòng)性 感染，AIDS患者、移植受者和老年人中，HCMV活動(dòng)性感染可引起多種疾病，甚至導(dǎo)致死亡； 在免疫功能尚未發(fā)育成熟的胎兒則為致畸性，導(dǎo)致出生缺陷。
[0003] 在我國目前HCMV的先天性感染率還不確定，但研究表明，發(fā)達(dá)國家先天性HCMV 感染率比發(fā)展中國家要低，其中意大利為0.47% (Cl :0.22 - 1.0% );瑞典為0.46% (CI:0. 37 - 0. 58% );岡比亞HCMV的先天性感染率高達(dá)13.6% ;美國為1%，每年約40000 新生兒伴有先天性HCMV感染，其中10%~15%發(fā)生遲發(fā)性后遺癥，主要為SNHL、智力障礙、 學(xué)習(xí)能力低下等神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，其中因 SNHL每年付出高達(dá)10億美元的醫(yī)療帳單。 2011年我國出生人口約1615萬，根據(jù)美國的數(shù)據(jù)推算，2011年我國約有16. 2萬新生兒發(fā) 生了先天性HCMV感染，家庭和國家都將為此支出高昂的成本，有學(xué)者報(bào)道，實(shí)際我國先天 性HCMV感染新生兒是16. 2萬人/年的2-3倍。
[0004] 在HIV患者中，HCMV是引起患者視網(wǎng)膜病變進(jìn)而失明的最主要病原體，截止到 2013年底我國共報(bào)告HIV感染者和艾滋病病人共43. 4萬例，而且感染情況呈上升趨勢。目 前的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可以大大延長HIV感染者的存活時(shí)間，甚至接近自然死亡年齡，但 是HCMV病毒感染引起的失明在HIV患者中急需解決。
[0005] 我國實(shí)施器官移植的例數(shù)也呈逐年增多的趨勢，2013年僅腎移植一項(xiàng)，我國就實(shí) 施6400余例。HCMV間質(zhì)性肺炎、GVHD是異基因骨髓移植最常見或最嚴(yán)重的并發(fā)癥，如發(fā)生 HCMV肺炎，病死率可高達(dá)80 %~90 %。
[0006] 在免疫衰老的老年人中HCMV感染會(huì)是多種慢性病的危險(xiǎn)因子尤其是心血管疾 病、糖尿病和腫瘤，直接影響壽命。一項(xiàng)研究通過檢測HCMV pp65T細(xì)胞反應(yīng)調(diào)查65歲以上 人群中HCMV細(xì)胞免疫水平，并對他們跟蹤調(diào)查生存率，發(fā)現(xiàn)pp65T細(xì)胞反應(yīng)陽性（對HCMV 有細(xì)胞免疫作用）的人群同一時(shí)間段的死亡率遠(yuǎn)低于PP65T細(xì)胞反應(yīng)陰性的人群（對HCMV 無細(xì)胞免疫作用），而且該人群中由心血管系統(tǒng)疾病死亡的比率出現(xiàn)了大于2倍的增加。臨 床也已觀察到在免疫低下人群中HCMV感染會(huì)減少胰島素的釋放，而且胰島β細(xì)胞是HCMV 的靶細(xì)胞，因此對HCMV的免疫防御低下也是二型糖尿病的危險(xiǎn)因素。此外，免疫衰老人群 HCMV感染還與腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病等慢性炎癥性疾病相關(guān)。
[0007] 目前還沒有可預(yù)防HCMV感染的疫苗，但臨床研究已發(fā)現(xiàn)早期抗病毒治療可以減 輕先天性感染兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷，挽救聽力；可以降低移植患者病死率、避免過度免疫抑 制；預(yù)防艾滋病人視網(wǎng)膜病變。因此，臨床急需快速、準(zhǔn)確的HCMV活動(dòng)性感染檢測手段，常 規(guī)病毒分離培養(yǎng)雖是HCMV診斷的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但需4周才能獲陽性結(jié)果，難以滿足快速診 斷的要求。ELISA法檢測HCMV特異性IgM抗體可用于免疫功能正常的HCMV活動(dòng)性感染 或HCMV病的診斷，但其陽性率低，在嚴(yán)重免疫抑制患者可缺乏抗體反應(yīng)或抗體延遲出現(xiàn)。 HCMV pp65為被膜蛋白，位于該病毒的衣殼和其包膜之間，屬于低基質(zhì)磷酸化蛋白，分子量 為65kD，占病毒總蛋白的15%，是激發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫的主要病毒蛋白。由于HCMV主要潛伏 于人外周血單個(gè)核細(xì)胞，發(fā)生再激活感染時(shí)病毒首先在單個(gè)核細(xì)胞中復(fù)制增殖，再隨血流 播散引起體液免疫反應(yīng)。因此，單個(gè)核細(xì)胞中PP65抗原出現(xiàn)的時(shí)間較特異性IgM抗體出現(xiàn) 早，且不會(huì)因?yàn)榛颊呙庖吖δ艿拖露磉_(dá)降低。同時(shí)檢測出PP65抗原血癥不僅可以說明存 在HCMV再激活感染，也可以說嗎患者缺失針對HCMV的細(xì)胞免疫力。因此，通過檢測患者 HCMV pp65抗原血癥是新近被臨床廣泛接受的檢測HCMV活動(dòng)性感染的"新金標(biāo)準(zhǔn)"。
[0008] 鑒于此，我們建立了利用監(jiān)測患者外周血pp65抗原血癥來診斷HCMV活動(dòng)性感染 的方法,并形成檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提出人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染快速檢測方法及用于該檢測方法 的試劑盒。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0011] 一種人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0012] (1)用紅細(xì)胞裂解液處理新鮮外周血標(biāo)本裂解紅細(xì)胞，再收集、洗滌離心沉淀獲得 相應(yīng)白細(xì)胞，制備檢測用的細(xì)胞涂片；
[0013] ⑵采用自制HCMV pp65單克隆抗體對細(xì)胞涂片進(jìn)行間接免疫熒光檢測；所述的 自制HCMV pp65單克隆抗體為從HCMV pp65真核表達(dá)載體免疫小鼠制備的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng) 上清中純化獲得；
[0014] (3)在熒光顯微鏡下觀察檢測結(jié)果；
[0015] (4)觀察結(jié)果需要在陽性對照和陰性對照同時(shí)成立的情況下才可信，樣品中出現(xiàn) > 1個(gè)陽性熒光信號即可判定為人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染陽性，出現(xiàn)> 50個(gè)陽性熒光信號 即可判定為人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染強(qiáng)陽性；
[0016] 所述的人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染快速檢測方法，其特征在于，
[0017] 所述的自制HCMV pp65單克隆抗體制備方法為：
[0018] A、HCMV pp 6OTNA重組質(zhì)粒的獲取
[0019] (1)根據(jù)Genebank中已公布的HCMV基因序列，確定HCMV pp 65基因編碼 序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HCMV pp 65的PCR引物，以HCMV AD169株RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再通過PCR擴(kuò)增出不含內(nèi)含子的UL83基因，將其克隆至pcDNA3. 0載體上，構(gòu)建重 組質(zhì)粒pcDNA3. 0-pp65,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提取質(zhì)粒，通過DNA測序獲得序列正確的 pcDNA3. 0_ρρ65 質(zhì)粒；
[0020] (2)將序列正確的pcDNA3. 0-ρρ65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞，24h后 Westernblotting鑒定其是否能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)HCMV pp65蛋白，鑒別出能夠在真核 細(xì)胞中表達(dá)HCMV pp65蛋白的序列正確的pcDNA3. 0-pp65質(zhì)粒；
[0021] (3)將含有鑒別出的PCDNA3. 0-PP65質(zhì)粒的菌種大量培養(yǎng)，收集菌體后通過堿裂 解法裂解菌體，再依次經(jīng)Sepharose 4FF分子篩、Plasmid Select親和層析和SOURCE 30Q 陰離子柱層析純化，得到純化后的PP65DNA重組質(zhì)粒；
[0022] B、小鼠免疫
[0023] 將純化后的pp65DNA重組質(zhì)粒與佐劑按3:1的比例混合，對小鼠進(jìn)行多點(diǎn)肌肉注 射；每隔2周免疫一次，共4次；最后一次免疫后1周，鼠尾采血通過瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)檢測抗 體滴度，取抗體滴度大于1:8的小鼠，處死后無菌取出脾臟，研磨法獲得免疫后的BALB/c小 鼠脾的細(xì)胞；
[0024] C、細(xì)胞融合
[0025] 取Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞按1:10的比例混合均勻， 1000 rpm離心10min，棄上清，置37°C水浴預(yù)熱，用Iml吸管在45s內(nèi)加完預(yù)熱至37°C的Iml 濃度50%的PEG 1500,邊加邊輕輕振蕩，然后在90s內(nèi)加入30ml預(yù)熱至37°C的1640不完 全培養(yǎng)基，室溫靜置lOmin，1000 rpm離心10min，棄上清，加入20ml含20% FCS和