在納米結(jié)構(gòu)裝置上選擇性捕獲并經(jīng)刺激釋放循環(huán)細胞的制作方法
【專利說明】在納米結(jié)構(gòu)裝置上選擇性捕獲并經(jīng)刺激釋放循環(huán)細胞
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年7月31日提交的美國臨時申請No. 61/677,825的優(yōu)先權(quán)， 其全部內(nèi)容均通過引用并入文本。
[0003] 本發(fā)明是在國立衛(wèi)生院授予的資助No. R21CA151159和R33 CA157396的政府支持 下完成的。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0004] 1.技術(shù)領域
[0005] 本發(fā)明當前要求保護之實施方案的領域涉及用于選擇性捕獲并經(jīng)刺激釋放循環(huán) 細胞的裝置和方法。
[0006] 2.相關(guān)技術(shù)討論
[0007] 循環(huán)腫瘤細胞[1] (circulating tumor cell，CTC)是從原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移部位脫 落并作為轉(zhuǎn)移瘤的細胞來源在外周血中循環(huán)的癌細胞[2]。目前用于癌癥診斷的金標準需要 侵入性活組織檢查和隨后對活檢樣品進行的組織病理學分析。然而，在早期轉(zhuǎn)移或復發(fā)時， 收集組織活檢樣品難以確定轉(zhuǎn)移/復發(fā)部位。因此，CTC可被認為是腫瘤的"液體活組織檢 查"，其能夠在致命性轉(zhuǎn)移發(fā)生之前方便地獲得腫瘤細胞。為了開發(fā)CTC作為可報告疾病進 展并指導治療實施的新癌癥"生物標志物"，大量的研宄努力 [3]致力于開發(fā)能夠檢測癌癥患 者血液中的CTC并對其進行計數(shù)的診斷測定。主要的技術(shù)挑戰(zhàn)在于從血液樣品的大量（IO 9 個細胞/mL)血細胞[4]中有效且特異性地捕獲豐度極低（數(shù)個至數(shù)百個細胞/mL)的CTC。 基于不同的工作機制，在過去幾十年中已開發(fā)了多種多樣的CTC測定。例如，免疫磁性分離 法 [5]利用包被有CTC特異性捕獲劑（例如，抗體或適配體）的磁珠來捕獲CTC?；诿庖叽?性分離的CellSearch?測定是可預測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌預后結(jié)果的唯 一經(jīng)FDA批準的CTC計數(shù)法。近來，開發(fā)了數(shù)種基于微芯片的技術(shù) [6]來解決CellSearch ? 測定所遇到的低CTC捕獲效率的問題。在此時，越來越多的新CTC測定已證明其對癌癥患 者的CTC計數(shù)具有極大的靈敏性。為了進一步開發(fā)CTC除計數(shù)之外的診斷價值，目前的研 宄機構(gòu)致力于建立CTC的分子和功能分析。可想到的是，CTC來源的分子信號和功能信息 將在治療性介入可造成顯著差異的關(guān)鍵窗口中為腫瘤生物學提供有價值的深入理解。為了 鋪平邁向CTC之分子分析和功能分析的道路，迫切需要開發(fā)這樣的新CTC測定，其不僅可高 效捕獲CTC，而且可以在周圍白細胞（WBC)的污染最小并且可忽略對CTC存活力和功能產(chǎn)生 的破壞的情況下釋放CTC。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用于從包含多種細胞類型的流體樣品中捕獲預選細 胞類型的裝置包括：基底；多條納米線（nanowire)，其中至少一條納米線與基底的表面連 接或與基底的表面成為一體使得多條納米線中的至少一條納米線具有未連接端；以及溫度 響應性材料層，其形成在多條納米線中每一條的至少未連接端上。溫度響應性材料層在第 一溫度下具有緊湊結(jié)構(gòu)并且在第二溫度下具有展開結(jié)構(gòu)，以便于使在第一溫度下捕獲的細 胞在第二溫度下釋放。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，從包含多種細胞類型的流體樣品中捕獲預選細胞類 型的方法包括：提供溫度響應性納米結(jié)構(gòu)（nanostructured)細胞捕獲裝置；使樣品沉積到 溫度響應性納米結(jié)構(gòu)細胞捕獲裝置的細胞捕獲表面上；改變溫度響應性納米結(jié)構(gòu)細胞捕獲 裝置的溫度以便于移除活的所捕獲細胞；以及在從溫度響應性納米結(jié)構(gòu)細胞捕獲裝置中移 除之后收集所捕獲細胞。
【附圖說明】
[0010] 考慮到描述、附圖和實例，其他目的和優(yōu)點將變得顯而易見。
[0011] 圖IA和IB提供了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的用于從包含多種細胞類型的流體樣 品中捕獲預選細胞類型的裝置的示意圖。
[0012] 圖2示出了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的圖IA和IB之裝置整合到流體芯片中的一 個實例。在該實施方案中，包括具有提高細胞-基底接觸頻率的蜿蜒混沌混合通道的重疊 聚二甲基硅氧烷（PDMS)。為了進行CTC捕獲，將裝置設定在37°C。隨后，包含CTC的血液樣 品流經(jīng)裝置，通道頂上的人字形微圖案引起微通道中的垂直流動。因此，CTC與NanoVelcro 基底之間的接觸頻率增加，導致CTC捕獲效率提高。在CTC在被捕獲（固定）在納米結(jié)構(gòu) 基底上后，就可將裝置設定為4°C，導致CTC從基底特異性釋放。
[0013] 圖3是為幫助解釋本發(fā)明一些實施方案的一些概念的示意性圖解。為了在該實施 例中賦予NanoVelcro CTC測定熱響應性，將經(jīng)生物素功能化的聚合物刷（即PIPAAm)共價 接枝到硅納米線基底（SiNWS)上。在37°C，生物素化PIPAAm的生物素基團和疏水結(jié)構(gòu)域 呈現(xiàn)在生物素-P-SiNWS的表面上。通過生物素-鏈霉親和素相互作用，可將生物素化抗 EpCAM引入到生物素-P-SiNWS上，從而實現(xiàn)高效的CTC捕獲。當將溫度冷卻至4°C時，經(jīng)表 面接枝的生物素化PIPAAm的骨架展開，導致CTC從基底釋放。
[0014] 圖4A至4C示出了 a)用于將生物素化PIPAAm共價接枝至SiNWS上的合成方法。 通過改變兩種單體前體的比例，可將三種不同密度（2. 5%、5%和10% )的生物素基團并入 到所得生物素-P-SiNWS上。b)采用接觸角來檢驗三種生物素-P-SiNWS的熱響應性。c) 將抗EpCAM引入到生物素-P-SiNWS上后，不管采用的溫度如何，表面都變成親水的。
[0015] 圖5A至提供了將本發(fā)明一個實施方案與替代結(jié)構(gòu)進行比較的數(shù)據(jù)。a)三種 具有不同密度（2. 5%、5%和10% )生物素基團的生物素-P-SiNWS的細胞捕獲/釋放性 能的定量評價。b)進行/未進行重復抗EpCAM綴合的多輪/連續(xù)循環(huán)研宄中10%生物 素-P-SiNWS的細胞捕獲/釋放性能。c)使用三種對照樣品進行細胞捕獲/釋放研宄：（i) PIPAAm-SiNWS、（ii)經(jīng)抗EpCAM包被的SiNWS和（iii)在平坦的硅芯片上的經(jīng)抗EpCAM包 被的生物素-P，其與10%生物素-P-SiNWS平行地進行檢驗。d)使用三種EpCAM陽性癌細 胞系（即MCF7、LnCAP和PC3癌細胞系）、兩種EpCAM陰性癌細胞系（即HeLa和Jurkat細 胞系）和新鮮分離的人白細胞對10%生物素-P-SiNWS的一般適用性和特異性進行的定量 評價。
[0016] 圖6A至6D提供了以下數(shù)據(jù)：a)三種不同類型的樣品中在不同細胞數(shù)（10至1000 細胞ml/ 1)的細胞捕獲效率：DMEM培養(yǎng)基（□)和全血（Λ) ;(b)使用經(jīng)抗EpCAM包被的生 物素-P-SiNWS (白色柱）和SiNWS (黑色柱）進行的MCF7細胞捕獲/釋放研宄中觀察到的 細胞釋放性能和所釋放細胞的存活力；c)經(jīng)DiO染色的MCF7細胞在被捕獲并從經(jīng)抗EpCAM 包被的生物素-P-SiNWS釋放后得到成功培養(yǎng)。
[0017] 圖7A至7D提供了以下數(shù)據(jù)：a)根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的熱響應性NanoVelcro CTC芯片在流率為0. 1、0. 2、0. 5、1、2和5mL IT1時的細胞捕獲效率。b)在PBS中評估所捕 獲細胞在熱響應性NanoVelcro芯片上的分布。大多數(shù)（78% ) CTC在前4個通道中被捕獲。 c)在37°C和4°C兩種溫度，在PBS中三種不同的肺癌細胞系（即表達EpCAM的A549、HCC827 和H2228)和對照細胞（即不表達EpCAM的Jurkat、Hela和WBC)的捕獲效率。所有的誤差 條均表示標準差（η >= 3)。d)在10細胞ml/1至1000細胞mL η的不同摻入細胞數(shù)的捕獲 效率。
[0018] 圖8A至8C提供了以下數(shù)據(jù)：a)作為流率和洗脫時間之函數(shù)的CTC釋放性能。由 這些數(shù)據(jù)確定了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的最佳條件（流率：〇. lmL/h和洗脫時間：20分 鐘）；b)可通過分別在37°C與4°C之間進行多個加熱和冷卻的循環(huán)來提高細胞釋放性能。 在4至5個加熱和冷卻的循環(huán)后可獲得優(yōu)異的細胞釋放性能。我們注意到，實驗數(shù)據(jù)是通 過在根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的新一代熱響應性NanoVelcro CTC芯片中捕獲約200個CTC 獲得的。在給定的加熱/冷卻循環(huán)后，從新一代熱響應性NanoVelcro CTC芯片中流出的洗 脫液中收集并計數(shù)CTC ;c)作為加熱/冷卻循環(huán)之函數(shù)的CTC純度和存活力。盡管多個加 熱/冷卻循環(huán)有助于CTC釋放性能，但是細胞存活力和純度在某種程度上受到破壞。
[0019] 發(fā)明詳述
[0020] 以下詳細討論了本發(fā)明的一些實施方案。在描述實施方案時，為清楚起見采用了 特定術(shù)語。但是，本發(fā)明并非旨在受所選特定術(shù)語限制。相關(guān)領域的技術(shù)人員應認識到，可 采用其他等價組件和開發(fā)其他方法而不背離本發(fā)明的廣義概念。本說明書（包括【背景技術(shù)】 和發(fā)明詳述部分）中任何地方引用的所有參考文獻均通過引用并入文本，如同每篇參考文 獻被單獨并入一樣。
[0021] "溫度響應性材料（temperature-responsive material) "或"熱響應性材料 (thermally responsive material) "或"熱響應性材料（thermoresponsive material) "是 對溫度變化表現(xiàn)出響應的任何材料，例如材料的一個或更多個特性隨溫度變化而變化。溫 度響應性材料一般經(jīng)歷一個或更多個特性的大幅