一種基于功能核酸利用共振散射光譜檢測17β-雌二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明食品領(lǐng)域，涉及一種檢測食品的方法，尤其涉及一種17 β-雌二醇，具體來 說是一種基于功能核酸利用共振散射光譜檢測17 β -雌二醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)境雌激素，又稱"內(nèi)分泌干擾化合物"，是一類廣泛地存在于環(huán)境中的污染物，可 擾亂人體及動物體的正常內(nèi)分泌功能，改變機(jī)體在發(fā)育和成年階段胞內(nèi)信號過程，從而造 成它們的生殖、免疫、神經(jīng)等系統(tǒng)的多種病變。然而，17 β -雌二醇是諸多環(huán)境雌激素中作 用最強(qiáng)烈的一種，普遍存在于各類環(huán)境，特別是水環(huán)境中，食品比如牛奶，蜂蜜等。17 β -雌 二醇在動物和人體內(nèi)合成，具有內(nèi)源性激素的活性，對人類和動物的影響是通過模擬、干擾 或?qū)箼C(jī)體內(nèi)生荷爾蒙原有的正常合成、運(yùn)輸、釋放和作用，使其無法維持自身的平衡和調(diào) -K- T。
[0003] 然而，就目前來看，傳統(tǒng)的方法（色譜法等）雖然檢測限很好，但是卻具有分析時 間長，操作復(fù)雜，需要大型精密儀器等缺點(diǎn)；免疫學(xué)方法雖然成本低廉但是容易出現(xiàn)假陽性 的結(jié)果；而電化學(xué)方法則需要對電極進(jìn)行修飾，識別能力不夠，因此，開發(fā)一種快速、靈敏、 便捷、實(shí)時檢測17 β -雌二醇的方法變的尤為重要。
[0004] 功能核酸是一種新型識別分子，其本質(zhì)是一段20-100bp長的單鏈DNA，是通過指 數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX)篩選而來的，可以特異性結(jié)合目標(biāo)分子。功能核酸容 易人工合成，易修飾，而且具有較高的選擇性和穩(wěn)定性，因此被廣泛應(yīng)用在檢測領(lǐng)域。本發(fā) 明所采用的17 β -雌二醇適配體，是由Kim等人在2007年首次篩選出并且應(yīng)用電化學(xué)方法 實(shí)現(xiàn)了對17 β-雌二醇的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于功能核酸利用共振散射 光譜檢測17 β -雌二醇的方法，所述的這種方法解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測17 β -雌二醇的方 法容易出現(xiàn)假陽性、成本高、檢測時間長的技術(shù)問題。
[0006] 本發(fā)明提供了一種基于功能核酸利用共振散射光譜檢測17 β -雌二醇方法，包括 以下步驟：
[0007] (1) -個制備適配體-納米金探針序列的步驟，所述的適配體為一段功能核苷酸 序列，所述的功能核苷酸的序列為：5' -GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CA G-AGG-GT A-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3'，將納米金和所述 的適配體結(jié)合，形成穩(wěn)定的適配體-納米金探針；
[0008] (2)在探針溶液中加入待檢測的懷疑含有17 β -雌二醇的水溶液，孵育，加入氯化 鈉溶液，通過測定共振散射信號強(qiáng)度來判斷待測溶液中17 β -雌二醇的含量。
[0009] 進(jìn)一步的，上述步驟（1)中，將功能核苷酸配制成1 μ mol/L的母液，步驟（2)中氯 化鈉溶液配制成濃度為2mol/L的母液。
[0010] 進(jìn)一步的，所述的納米金納米金通過以下方法制備：在每100毫升煮沸的質(zhì)量百 分比濃度為0. 01 %的氯金酸溶液中，加入3. 5毫升質(zhì)量百分比濃度為1 %的檸檬酸三鈉溶 液，攪拌30分鐘，移除加熱裝置后繼續(xù)攪拌混合物10分鐘，最后，使溶液達(dá)到室溫并且使用 0. 2 μ m超濾膜過濾，然后儲存在恒溫為4度的黑色玻璃瓶中備用。
[0011] 進(jìn)一步的，上述步驟（1)中，檢測體系中功能核酸的終濃度為20nM，使用量為 1 μ mol/L的母液取10 μ L，納米金的使用量為100 μ L，步驟⑵中，檢測體系中氯化鈉的濃 度為120禮，使用量為2111〇1/1母液取3(^1^
[0012] 具體的，上述的基于功能核酸利用共振散射光譜檢測17 β-雌二醇方法，包括以 下步驟：
[0013] (1) 一個建立已知17β-雌二醇濃度的檢測體系的步驟，取至少六支分別加入 10 μ L，1 μ mol/L 17 β -雌二醇適配體的離心管，加入100 μ L納米金溶液，充分混勻后將離 心管置于25°C條件下孵育15min，然后分別加入10 μ L不同濃度的17 β -雌二醇溶液，使得 整個檢測體系中17 β -雌二醇的含量維持在0. 1-3. 0 μ mol/L，然后充分混勻后再將離心管 置于25°C條件下孵育15min，在上述混合液中加入30 μ L、2mol/L的氯化鈉溶液充分混勻并 且采用緩沖液定容至500 μ L，留作以下測定用；
[0014] (2)另取1支離心管將17 β-雌二醇溶液用10 μ L超純水替代，按照上述步驟（1) 的方法處理后作為空白對照體系溶液；
[0015] (3)分別取500 yL步驟（1)和步驟⑵制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液，置于石英 熒光比色皿中，所述的石英熒光比色皿的內(nèi)徑為〇· 5cmX0. 5cm，外徑為1.0 cmX I. 0cm，用 熒光光度計進(jìn)行掃描測定信號，掃描條件為：激發(fā)光狹縫為2. 5nm，發(fā)射光狹縫為2. 5nm，激 發(fā)光波長為550nm條件下掃描，獲得其共振散射信號光譜，17 β -雌二醇和空白對照液的共 振散射光譜信號分別為I55tol和（I55tlnm) b,計算相對共振散射強(qiáng)度值ΔΙ = I55toi-(I55toi)b;
[0016] (4)以不同濃度17 β -雌二醇（Ce2)與對應(yīng)的相對共振散射強(qiáng)度值Λ I作圖，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0017] (5)制備樣品檢測體系：取IOyL待測樣品，加入到步驟⑴方法制備的檢測體系 離心管中，充分混勻后再將離心管置于25°C條件下孵育15min后，在混合液中加入30 μ L、 2mol/L的氯化鈉溶液充分混勻并且緩沖液定容至500 μ L，按步驟（3)方法測定共振散射信 號并計算Δ I。
[0018] (6)根據(jù)計算所得的ΛΙ值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品中17β-雌二醇含量。
[0019] 進(jìn)一步的，所述的緩沖液為丙磺酸緩沖液，濃度為10mm〇l/L，PH值為7. 0。
[0020] 本發(fā)明的原理是：通過使用納米金與17 β -雌二醇的適配體與功能核酸相結(jié) 合形成適配體-納米金探針，當(dāng)檢測體系中沒有17 β -雌二醇時，適配體-納米金探針相 對穩(wěn)定，當(dāng)加入高濃度鹽溶液氯化鈉時，溶液不會發(fā)生變化，共振散射信號不變；當(dāng)檢測體 系中存在17 β -雌二醇時，適配體-納米金探針上的17 β -雌二醇適配體會與17 β -雌二 醇發(fā)生特異性結(jié)合，從而釋放出納米金顆粒，當(dāng)加入高濃度鹽溶液氯化鈉時，納米金顆粒發(fā) 生聚集，共振散射信號大大增加，并且隨著17 β -雌二醇濃度的增加，共振散射信號不斷增 加。通過比較共振散射值的變化，即可實(shí)現(xiàn)對17 β -雌二醇的檢測。
[0021] 本發(fā)明建立了一種基于17 β -雌二醇適配體利用共振散射光譜實(shí)現(xiàn)對17 β -雌二 醇的檢測方法。納米金具有較好的穩(wěn)定性、生物相容性和共振瑞利散射效應(yīng)，能與功能核 酸組合成探針在共振瑞利散射光譜分析方面具有很好的應(yīng)用；而共振瑞利散射光譜法是一 種簡便、快速、靈敏的光譜分析新技術(shù)，在核酸、蛋白質(zhì)、小分子分析等領(lǐng)域獲得了較好的應(yīng) 用。本發(fā)明在基于功能核酸的基礎(chǔ)上，利用共振散射光譜對食品（包括牛奶）中17β-雌 二醇進(jìn)行快速、靈敏、便捷、實(shí)時檢測。
[0022] 本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明提供的檢測方法不需要大 型儀器設(shè)備，成本低，檢測靈敏度高，選擇性好，操作簡單且高效，可用于檢測食品包括牛奶 中17 β _雌二醇的含量，檢測的濃度范圍是0· 1-3. 0 μ mol/L，最低檢測限為9. OnMo
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發(fā)明檢測17 β-雌二醇的原理圖。
[0024] 圖2顯示了優(yōu)化方法中不同氯化鈉濃度的相對共振散射值。
[0025] 圖3顯示了優(yōu)化方法中不同17 β -雌二醇適配體濃度的相對共振散射值。
[0026] 圖4顯示了檢測體系的共振散射信號變化與不同濃度17 β -雌二醇的關(guān)系。
[0027] 圖5顯示了是不同其他物質(zhì)加入該檢測體系后的共振散射信號變化量。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1優(yōu)化體系中氯化鈉濃度
[0029] 在1.5mL離心管中加入IOOyL納米金溶液，再加入丙磺酸緩沖液（濃度為 10mm 〇l/L、PH為7. 0)，混勻，依次加入濃度范圍為0-160mmol/L的氯化鈉溶液，五分鐘之后 測定共振散射值，得到相對共振散射值，繪制曲線，峰值最高對應(yīng)的氯化鈉濃度為120mmol/ L，如圖2所示。
[0030] 實(shí)施例2優(yōu)化體系中17 β -雌二醇適配體濃度
[0031] 17 β-雌二醇適配體購于上海生工，將收到的樣品配制成lymol/L的母液，然后 分別加入濃度范圍為0-40nmol/L的適配體于100 μ L納米金溶液中配制成適配體-納米金 探針，孵育15min后加入一定濃度的雌二醇溶液，孵育15min，加入優(yōu)化好的氯化鈉溶液，丙 磺酸緩沖液定容至500 μ L，五分鐘后測定共振散射值，繪制曲線，峰值最高處對應(yīng)的適配體 濃度為20nmol