圍為40~50mbar，時(shí)間范圍為10~20s ;柱溫范圍為25~35°C，檢測 波長為紫外214nm。
[0029] 作為實(shí)例，在下面給出毛細(xì)管電泳分離的一個(gè)優(yōu)選條件：
[0030] 石英毛細(xì)管內(nèi)徑50 μ m，總長120cm;緩沖溶液為IOmM氯化鈉，IOmM甘氨酸，IOmM 乙酸鈉，7M尿素，2. 5mM腐胺，pH為3. 8 ;電泳時(shí)采用壓力進(jìn)樣，壓力為50mbar，時(shí)間15s ;分 離電壓30kv ;柱溫35°C ;檢測波長紫外214nm。
[0031] 從圖1中可以看出，利用本發(fā)明所述的毛細(xì)管電泳方法可以實(shí)現(xiàn)達(dá)依泊汀α完全 的基線分離。不同來源的達(dá)依泊汀α樣品可能產(chǎn)生不同的目標(biāo)分離峰。本發(fā)明實(shí)施例2中 共產(chǎn)生6個(gè)糖組分峰，其中48. 042 (峰2) ,49. 700 (峰3) ,51. 429 (峰4)以及53. 121 (峰 5)的峰為主要的目標(biāo)峰。通過荷質(zhì)比和電泳淌度的關(guān)系以及質(zhì)譜分析表明，這些目標(biāo)峰對 應(yīng)唾液酸殘基量分別為18, 19, 20和21的達(dá)依泊汀α糖蛋白，峰6為22個(gè)唾液酸殘基的 達(dá)依泊汀α。各組分的定量檢測依據(jù)為，通過計(jì)算分離的目標(biāo)峰面積占所有分離峰面積的 百分比，得到該組分在含有達(dá)依泊汀α樣品中微不均一性的混合蛋白中的百分含量。從表 1中可以看出，峰2-6的比例在95%以上。即利用該方法可以檢測出達(dá)依泊汀α樣品中具 有18-22個(gè)唾液酸殘基的達(dá)依泊汀α組分的含量，從而可以用于產(chǎn)品生產(chǎn)中的質(zhì)量控制。
【附圖說明】
[0032] 圖IEPO和達(dá)依泊汀α的糖基化示意圖，其中的小圓圈代表唾液酸殘基。
[0033] 圖2達(dá)依泊汀α的毛細(xì)管電泳分離圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 實(shí)施例1樣品溶液配制
[0035] (I)CZE緩沖母液：0.1 M氯化鈉，0.1 M甘氨酸，0.1 M乙酸鈉
[0036] 精密稱取氯化鈉 0· 584g，甘氨酸I. 792g，乙酸鈉 0· 820g，置于100mL的燒杯中，加 適量的超純水使之溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，備用。
[0037] (2) IM腐胺溶液
[0038] 精密稱取腐胺0.882g，置于IOml的燒杯中，加適量的超純水使之溶解，轉(zhuǎn)移至 IOml容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，再分成0. 5ml每等份，備用。
[0039] (3) CZE緩沖液：0.0 lM氯化鈉，0.0 lM甘氨酸，0.0 lM乙酸鈉，7M尿素，2. 5mM腐胺
[0040] 稱取尿素21. Og置于50ml燒杯中，加入25ml水中，30°C使其溶解，加入5ml的CZE 母液和125 μ 1的IM腐胺，使之溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3. 8,轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加超 純水至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的膜過濾后備用。
[0041] 實(shí)施例2毛細(xì)管電泳條件
[0042] 所用儀器為貝克曼P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀。毛細(xì)管柱：未涂層毛細(xì)管，毛細(xì)管長 度為120厘米，內(nèi)徑50微米；電泳緩沖溶液為IOmM氯化鈉，IOmM甘氨酸，IOmM乙酸鈉，7M尿 素，2. 5mM腐胺，pH為3. 8 ;電泳時(shí)采用壓力進(jìn)樣，壓力為50mbar，時(shí)間15s ;分離電壓30kv ; 柱溫35°C ;檢測波長紫外為設(shè)定214nm。
[0043] 達(dá)依泊汀α樣品購自美國Amgen公司，利用上述的條件進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳分 離圖如圖1所示
[0044] 實(shí)施例3樣品分析
[0045] 從圖1中可以看出，達(dá)依泊汀α實(shí)現(xiàn)了完全的基線分離，共產(chǎn)生6個(gè)糖組分峰，其 中48. 042 (峰2)，49. 700 (峰3)，51. 429 (峰4)以及53. 121 (峰5)的峰為主要的目標(biāo)峰。 收集這些分離峰組分進(jìn)行質(zhì)譜分析，表明這些目標(biāo)峰對應(yīng)唾液酸殘基量分別為18, 19, 20 和21的達(dá)依泊汀α糖蛋白，峰6為22個(gè)唾液酸殘基的達(dá)依泊汀α。從表1中可以看出， 18-22個(gè)唾液酸糖基的達(dá)依泊汀α的比例在95%以上。即利用該方法可以檢測出達(dá)依泊 汀α樣品中具有18-22個(gè)唾液酸殘基的達(dá)依泊汀α組分的含量，從而可以用于產(chǎn)品生產(chǎn) 中的質(zhì)量檢測及控制。
[0046] 表1達(dá)依泊汀α各糖組分峰面積及百分含量
[0047]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種達(dá)依泊汀a精細(xì)結(jié)構(gòu)的毛細(xì)管電泳檢測方法，所述方法包括如下的步驟： (1) 、通過毛細(xì)管電泳對含有達(dá)依泊汀a的樣品進(jìn)行分離； (2) 、根據(jù)色譜峰面積對具有不同糖組分達(dá)依泊汀a進(jìn)行定量測定； 其中，所述的毛細(xì)管電泳條件中，電泳緩沖液包括能維持在水溶液狀態(tài)下pH范圍為 3. 3-5. 5的任一種緩沖液、1-lOmM的腐胺和1-9M的尿素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（1)中，石 英毛細(xì)管總長范圍為70~200cm，柱內(nèi)徑為25~75 ii m。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（1)中，毛 細(xì)管電泳的電極電壓為10~50kv。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（1)中，毛 細(xì)管電泳采用壓力進(jìn)樣，壓力范圍為30~60mbar，時(shí)間范圍為5~30s。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（1)中，毛 細(xì)管電泳的柱溫范圍為10~40°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（1)中，毛 細(xì)管電泳時(shí)所使用檢測波長為紫外210-232nm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（1)中，毛 細(xì)管電泳分離的條件范圍為：石英毛細(xì)管總長范圍在70~200cm之間，柱內(nèi)徑可以用25~ 75 y m ;所用的毛細(xì)管電泳緩沖液包括能維持在水溶液狀態(tài)下pH范圍為3. 3-5. 5的任一種 緩沖液、l-l〇mM的腐胺和1-9M的尿素；毛細(xì)管電泳的電極電壓為10~50kv ;電泳時(shí)采用壓 力進(jìn)樣，壓力范圍為30~60mbar，時(shí)間范圍為5~30s ;柱溫范圍為10~40°C，檢測波長 為紫外 210-232nm。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（1)中，毛 細(xì)管電泳分離的條件范圍為：石英毛細(xì)管總長范圍在90~140cm之間，柱內(nèi)徑可以用40~ 60 y m ;毛細(xì)管電泳緩沖溶液可選自醋酸緩沖液或磷酸緩沖液，pH范圍為3. 6~4. 5,緩沖溶 液中可加入l-l〇mM腐胺和1-9M尿素；毛細(xì)管電泳的電極電壓為10~50kv ;電泳時(shí)采用壓 力進(jìn)樣，壓力范圍為30~60mbar，時(shí)間范圍為5~30s ;柱溫范圍為10~40°C，檢測波長 為紫外 210-232nm。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（1)中，毛 細(xì)管電泳分離的條件范圍為：本發(fā)明所使用石英毛細(xì)管總長范圍在90~140cm之間，柱內(nèi) 徑可以用40~60μm ;毛細(xì)管電泳緩沖溶液包含1~lOOmM氯化鈉，1~lOOmM甘氨酸，1~ 100mM乙酸鈉,4~9M尿素，l-10mM腐胺，pH范圍為3. 6~4. 5 ;毛細(xì)管電泳的電極電壓為 20~40kv ;電泳時(shí)采用壓力進(jìn)樣，壓力范圍為40~50mbar，時(shí)間范圍為10~20s ;柱溫范 圍為25~35°C，檢測波長為紫外214nm。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳檢測方法，其特征在于：所述方法步驟（2)中，各 組分的定量檢測依據(jù)為，通過計(jì)算分離的目標(biāo)峰面積占所有分離峰面積的百分比，得到該 組分在含有達(dá)依泊汀a樣品中微不均一性的混合糖基化蛋白中的百分含量。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種達(dá)依泊汀α精細(xì)結(jié)構(gòu)的毛細(xì)管電泳分析方法，毛細(xì)管電泳分離的條件為石英毛細(xì)管總長范圍在70～200cm之間，柱內(nèi)徑可以用25～75μm；所用的毛細(xì)管電泳緩沖液包括能維持在水溶液狀態(tài)下pH范圍為3.3-5.5的任一種緩沖液、1-10mM的腐胺和1-9M的尿素；毛細(xì)管電泳的電極電壓為10～50kv；電泳時(shí)采用壓力進(jìn)樣，壓力范圍為30～60mbar，時(shí)間范圍為5～30s；柱溫范圍為10～40℃，檢測波長為紫外210-232nm。利用本發(fā)明所述的毛細(xì)管電泳方法可以實(shí)現(xiàn)達(dá)依泊汀α完全的基線分離，共產(chǎn)生6個(gè)糖組分峰，本方法可以用于達(dá)依泊汀α藥物在生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。
【IPC分類】G01N27-447
【公開號】CN104677971
【申請?zhí)枴緾N201310608883
【發(fā)明人】金榮, 王芳, 單劍鋒, 陳歷, 樓丹
【申請人】杭州九源基因工程有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2013年11月26日