單克隆抗體stro-4的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是2009年8月18日提交的題為"單克隆抗體STR0-4"的中國專利申請 200980141163. 9的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及熱休克蛋白-90β (HSP_90f3)作為鑒定和/或分離多潛能細(xì)胞的標(biāo) 記物的用途。更具體地，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人和綿羊HSP_9O0的單克隆抗體（稱為 STR0-4)的鑒定。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法富集的細(xì)胞群和這些細(xì)胞的治療用途。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 包含造血支持性骨髓基質(zhì)和相關(guān)骨組織的細(xì)胞組分源自一群多潛能細(xì)胞，該多潛 能細(xì)胞包括多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)和它們的前體（間充質(zhì)前體細(xì)胞（MPC))。MPC存在 于主要位于環(huán)繞血管的血管周圍生態(tài)位的骨髓空間中（Gronthos S et al.，2003和Shi S et al.，2003)。在過去二十年中，研宄集中于不同人基質(zhì)/間充質(zhì)細(xì)胞群重建脂肪、骨、軟 骨和肌肉的再生潛能（Gronthos S et al·，2003和Simmons PJ et al·，1991)。但是，這些 技術(shù)的成功應(yīng)用取決于以下能力：分離純化的MPC群，以及隨后離體控制它們的生長和分 化。此外，需要克服通常與基于干細(xì)胞的療法有關(guān)的各種技術(shù)和安全性顧慮，這通過在合適 的大量人疾病臨床前動物模型代表中評價MPC制品（preparation)的安全性和功效實現(xiàn)。 人矯形和心臟疾病/創(chuàng)傷的綿羊模型已得到廣泛使用，因為綿羊與人解剖、生理、免疫學(xué)和 胚胎發(fā)育具有相似性（Airey JA et al·，2004 ;Liechty KW et al·，2000 和 Mackenzie TC et al. , 2001) 〇
[0005] 同時，數(shù)種人多潛能細(xì)胞特異性標(biāo)記物如STR0-1、⑶106、⑶146已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn) 行了描述（Gronthos S et al·，2003和Shi S et al·，2003)，在人疾病綿羊模型中檢查多 潛能細(xì)胞的治療潛力的顯著進(jìn)展受到限制，這是因為缺乏允許分離和表征綿羊組織中等同 的多潛能細(xì)胞群的特異性試劑。諸如單克隆抗體的與綿羊和人多潛能細(xì)胞均反應(yīng)的生物學(xué) 試劑的開發(fā)分別會極大促進(jìn)在臨床前和臨床試驗中監(jiān)測和等同綿羊和人多潛能細(xì)胞群的 功能性的能力。
[0006] 已包括在本說明書中的關(guān)于文獻(xiàn)、法規(guī)、材料、裝置、論文等的任何討論只是為了 提供本發(fā)明的背景。其不應(yīng)被視作承認(rèn)任何或全部這些內(nèi)容由于存在于本申請每項權(quán)利要 求的優(yōu)先權(quán)日之前而構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的公知常識。
[0007] 發(fā)明概沐
[0008] 本發(fā)明描述了一種稱為STR0-4的新單克隆抗體（mAb)的產(chǎn)生和表征，該單克隆抗 體從未分級的綿羊和人骨髓鑒定和分離多潛能細(xì)胞。具體地，STR0-4抗體能夠在兩個物種 中基本上分離全部產(chǎn)克隆多潛能細(xì)胞（CFU-F :成纖維細(xì)胞集落形成單位）。分離的多潛能 細(xì)胞表現(xiàn)出高增殖潛能和多譜系分化。
[0009] 出人意料的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-90 MHSP-90f3)蛋白在體內(nèi)多潛能細(xì)胞 的細(xì)胞表面表達(dá)，并且據(jù)發(fā)現(xiàn)單克隆抗體STR0-4鑒定HSP-90 β上表達(dá)的獨特表位。
[0010]因此，在一實施方案中，本發(fā)明提供了 HSP-90f3作為鑒定和/或富集多潛能細(xì)胞 的標(biāo)記物的用途。
[0011] 在一實施方案中，本發(fā)明提供了一種富集多潛能細(xì)胞的方法，所述方法包括從組 織來源制備細(xì)胞樣品并且富集表達(dá)所述HSP-90 β標(biāo)記物的細(xì)胞。
[0012] 在本發(fā)明的一實施方案中，多潛能細(xì)胞是成體多潛能細(xì)胞。
[0013] 在一實施方案中，本發(fā)明的富集的細(xì)胞群沒有被體外培養(yǎng)。
[0014] 在另一實施方案中，本發(fā)明的富集的細(xì)胞群能夠產(chǎn)生產(chǎn)克隆CFU-F。
[0015] 在另一實施方案中，富集的細(xì)胞群對于HSP-90 β +/STR0-4+細(xì)胞是同質(zhì) (homogenous)的。
[0016] 在一個實例中，富集多潛能細(xì)胞的方法包括：
[0017] 使細(xì)胞樣品與HSP-90 β結(jié)合劑接觸；和
[0018] 將結(jié)合所述HSP-90 β結(jié)合劑的細(xì)胞與不結(jié)合所述HSP-90 β結(jié)合劑的細(xì)胞分離。
[0019] 在另一實施方案中，本發(fā)明還提供了一種鑒定細(xì)胞樣品中多潛能細(xì)胞的存在的方 法，所述方法包括鑒定樣品中表達(dá)所述HSP-90 β標(biāo)記物的細(xì)胞。
[0020] 在一實例中，鑒定細(xì)胞樣品中多潛能細(xì)胞存在的方法包括：
[0021] 從組織來源獲得細(xì)胞樣品；
[0022] 在適合于HSP_90f3與所述HSP_90f3結(jié)合劑結(jié)合的條件下，使所述細(xì)胞樣品與 HSP_90f3結(jié)合劑接觸；和
[0023] 檢測結(jié)合所述樣品中細(xì)胞的HSP_90f3結(jié)合劑的存在，其中結(jié)合所述HSP_90f3結(jié) 合劑的細(xì)胞指示多潛能細(xì)胞的存在。
[0024] 細(xì)胞樣品可以源自疑似含有多潛能細(xì)胞的任何組織來源。例如，組織來源可以是 胎盤、脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結(jié)、胸腺、 卵巢、胰、骨、韌帶、骨髓、腱或骨骼肌。在優(yōu)選實施方案中，組織來源是骨髓。
[0025] 富集多潛能細(xì)胞的細(xì)胞來源可以是人或綿羊來源。但是，本發(fā)明還適用于源自其 他動物物種的細(xì)胞，包括牛、馬、鼠、豬、犬或貓。
[0026] 本發(fā)明還涉及從本發(fā)明多潛能細(xì)胞的體外培養(yǎng)產(chǎn)生的子代細(xì)胞。本發(fā)明的擴增的 細(xì)胞可以具有多種表型，這取決于培養(yǎng)條件（包括培養(yǎng)基中刺激因子的數(shù)量和/或類型）、 傳代次數(shù)等。
[0027] 在另一實施方案中，培養(yǎng)本發(fā)明的富集群產(chǎn)生還表達(dá)選自以下標(biāo)記物的一種或多 種標(biāo)記物的多潛能細(xì)胞：STRO-I、STRO-3 (TNSAP)、LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、 P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD 18、CD61、 整合蛋白0、6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、〇)1〇、〇)13、5〇卩、？〇6卩-1?36卩-1?、16卩1-1?、如卩-1?、卩6卩-1?、 瘦蛋白-R、（STRO-2 =瘦蛋白-R)、RANKL、STRO-Itarigh^ CD146或這些標(biāo)記物的任意組合。
[0028] 在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的多潛能細(xì)胞在培養(yǎng)時不能產(chǎn)生造血細(xì)胞。
[0029] 本發(fā)明的方法還可以包括在第一富集步驟之前收獲多潛能細(xì)胞來源的步驟。這可 以包括，例如從受試者手術(shù)取出組織，并且從該組織分離細(xì)胞以形成單細(xì)胞懸液。這種分離 可以通過物理或酶促方式實現(xiàn)。這類方式是本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。在本發(fā)明的一 實例中，這個步驟涉及使用已知技術(shù)收集骨髓細(xì)胞。
[0030] 用于本發(fā)明方法的HSP-90f3結(jié)合劑可以是鑒定為具有對HSP-90f3的結(jié)合親和力 的任何多肽或化合物。
[0031 ] 優(yōu)選地，HSP-90 β結(jié)合劑特異性結(jié)合HSP-90 β。
[0032] 優(yōu)選地，HSP-9O0結(jié)合劑特異性結(jié)合HSP-9O0上的表位，其中HSP-9O0包含與 SEQ ID ΝΟ:1(圖5)的序列至少約75%相同的序列，優(yōu)選與SEQ ID ΝΟ:1至少約78%相同， 更優(yōu)選至少約80 %相同，仍然更優(yōu)選至少約85 %相同，仍然更優(yōu)選至少約90 %相同，甚至 更優(yōu)選與 SEQ ID ΝΟ:1 至少約 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同。
[0033] 在一實施方案中，HSP-90I3結(jié)合劑選自肽、擬肽類（peptidomimetic)、核酸適配 體、肽適配體、樹狀聚體和小有機分子。
[0034] 在一實例中，HSP_90f3結(jié)合劑是寡核苷酸。優(yōu)選地，寡核苷酸是標(biāo)記的寡核苷酸。
[0035] 在另一實施方案中，HSP_90f3結(jié)合劑是純化的抗HSP_90f3抗體或其抗原結(jié)合片 段或衍生物。抗HSP-9O0抗體可以是單克隆抗體、重組抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0036] 在本發(fā)明的一實施方案中，抗HSP_90f3單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的 STR0-4抗體，所述雜交瘤細(xì)胞系依據(jù)布達(dá)佩斯條約（Budapest Treaty)的條款于2008年7 月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-9362。
[0037] 用于本發(fā)明方法的其他合適的抗HSP-90 β單克隆抗體包括可商購的抗 體，如小鼠抗人Hsp9O0mAb克隆H9010(Invitrogen)、小鼠抗Hsp90b mAb克隆 EMD-5E12 (Calbiochem)、小鼠抗人 HSP9O0 mAb 克隆 K3725B (Cosmo Bio Co. ,Ltd)和小鼠抗 人 Hsp9O0mAb 克隆 K3705 (Assay Designs/Stressgen Bioreagents)。上文未提及的其他 可商購的抗體考慮為在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0038] 在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種HSP_90f3結(jié)合劑或其抗原結(jié)合片段或衍 生物，其選自：
[0039] (i) STR0-4 單克隆抗體；
[0040] (i