高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于共焦顯微成像技術(shù)和質(zhì)譜成像技術(shù)領(lǐng)域，將激光共焦顯微成像技術(shù)與質(zhì)譜成像技術(shù)相結(jié)合，涉及一種高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，可用于生物質(zhì)譜成像領(lǐng)域的高分辨成像。
技術(shù)背景
[0002]質(zhì)譜儀(Mass Spectrometry)是將樣品中的組分發(fā)生電離，使生成的不同荷質(zhì)比的帶電原子、分子或分子碎片在電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用下分別聚焦而得到按質(zhì)荷比大小順序排列的圖譜儀器。質(zhì)譜成像是對(duì)樣品二維區(qū)域內(nèi)多個(gè)微小區(qū)域分別進(jìn)行質(zhì)譜分析來檢測(cè)特定質(zhì)荷比(m/z)物質(zhì)的分布。
[0003]自上世紀(jì)80年代中期基質(zhì)輔助激光解吸電離這種高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍生物質(zhì)譜成像技術(shù)的出現(xiàn)，開拓了質(zhì)譜學(xué)一個(gè)嶄新的領(lǐng)域一生物質(zhì)譜，促使質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用范圍擴(kuò)展到生命科學(xué)研宄的眾多領(lǐng)域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、核酸、糖蛋白分析等方面的應(yīng)用，不僅為生命科學(xué)研宄提供了新手段，而且也促進(jìn)了質(zhì)譜技術(shù)自身的發(fā)展。
[0004]但現(xiàn)有基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜儀存在以下突出問題:
[0005]I)由于利用簡(jiǎn)單的激光聚焦來解吸電離樣品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、質(zhì)譜探測(cè)空間分辨力不高等問題；
[0006]2)質(zhì)譜成像所需時(shí)間長(zhǎng)，激光質(zhì)譜儀聚焦光斑軸向位置相對(duì)被測(cè)樣品常發(fā)生漂移冋題。
[0007]而生物樣品“微區(qū)”質(zhì)譜信息的準(zhǔn)確獲取對(duì)于生命科學(xué)研宄具有極其重要的意義。事實(shí)上，目前如何高靈敏地探測(cè)微區(qū)質(zhì)譜信息是生物質(zhì)譜領(lǐng)域亟待研宄的重要技術(shù)問題。
[0008]激光共焦顯微鏡“點(diǎn)照明”和“點(diǎn)探測(cè)”的成像探測(cè)機(jī)制，不僅使其橫向分辨力較同等參數(shù)的光學(xué)顯微鏡改善1.4倍，而且還使共焦顯微鏡極便于與超分辨光瞳濾波技術(shù)、徑向偏振光緊聚焦技術(shù)等結(jié)合來壓縮聚焦光斑，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高空間分辨顯微成像。
[0009]基于此，本發(fā)明提出一種高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，其將激光共焦顯微鏡聚焦光斑的探測(cè)功能與激光聚焦解吸電離功能相融合，利用經(jīng)超分辨技術(shù)處理的共焦顯微鏡的微小聚焦光斑對(duì)樣品進(jìn)行高空間分辨成像，利用共焦顯微鏡同一聚焦光斑對(duì)樣品進(jìn)行解吸電離供質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行成像，繼而實(shí)現(xiàn)被測(cè)樣品微區(qū)的高空間分辨圖像成像和高空間分辨質(zhì)譜顯微成像。
[0010]本發(fā)明提出一種高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置可為生物質(zhì)譜高分辨成像提供一個(gè)全新的有效技術(shù)途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是為了提高質(zhì)譜顯微成像技術(shù)的空間分辨力、抑制成像過程中聚焦光斑相對(duì)樣品的漂移，提出一種高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，以期同時(shí)獲得被測(cè)樣品成分空間信息和功能信息。
[0012]本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0013]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法，是利用高空間分辨共焦顯微系統(tǒng)的聚焦光斑對(duì)樣品進(jìn)行軸向定焦與成像，利用高空間分辨共焦顯微系統(tǒng)的同一聚焦光斑對(duì)樣品進(jìn)行解吸電離來進(jìn)行質(zhì)譜成像，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)圖像與組分的高空間分辨成像，包括以下步驟:
[0014]步驟一、使平行光束通過環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)后整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束再經(jīng)分光鏡、中孔反射鏡反射進(jìn)入中孔測(cè)量物鏡并聚焦到被測(cè)樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽；
[0015]步驟二、使計(jì)算機(jī)控制由中孔測(cè)量物鏡、軸向物鏡掃描器、中孔反射鏡、分光鏡、集光透鏡和光強(qiáng)點(diǎn)探測(cè)器構(gòu)成的激光共焦探測(cè)系統(tǒng)通過軸向物鏡掃描器對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行軸向掃描測(cè)得共焦軸向強(qiáng)度曲線；
[0016]步驟三、將共焦軸向強(qiáng)度曲線沿z向平移s后得到移位共焦軸向強(qiáng)度曲線，然后將移位共焦軸向強(qiáng)度曲線與共焦軸向強(qiáng)度曲線相減處理得到錯(cuò)位相減共焦曲線；
[0017]步驟四、將錯(cuò)位相減共焦曲線的零點(diǎn)位置zA減去平移值s/2得(z a-s/2)，計(jì)算機(jī)依據(jù)(za-s/2)值控制軸向物鏡掃描器使中孔測(cè)量物鏡的聚焦光斑聚焦到被測(cè)樣品上；
[0018]步驟五、利用電離樣品吸管將聚焦光斑解吸電離被測(cè)樣品產(chǎn)生的等離子體羽中的分子、原子和離子吸入質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行質(zhì)譜成像，測(cè)得對(duì)應(yīng)聚焦光斑區(qū)域的質(zhì)譜信息;
[0019]步驟六、利用由中孔測(cè)量物鏡、軸向物鏡掃描器、中孔反射鏡、分光鏡、集光透鏡和位于激光透鏡焦點(diǎn)的光強(qiáng)點(diǎn)探測(cè)器構(gòu)成的激光共焦探測(cè)系統(tǒng)對(duì)中孔測(cè)量物鏡聚焦到被測(cè)樣品的微區(qū)進(jìn)行成像，測(cè)得對(duì)應(yīng)聚焦光斑區(qū)域的形態(tài)信息；
[0020]步驟七、計(jì)算機(jī)將激光共焦探測(cè)系統(tǒng)測(cè)得的激光聚焦微區(qū)形態(tài)信息與質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)同時(shí)測(cè)得的激光聚焦微區(qū)的質(zhì)譜信息進(jìn)行融合處理，繼而得到聚焦光斑微區(qū)的形態(tài)和質(zhì)譜信息；
[0021]步驟八、計(jì)算機(jī)控制二維工作臺(tái)使中孔測(cè)量物鏡對(duì)準(zhǔn)被測(cè)樣品的下一個(gè)待測(cè)區(qū)域，然后按步驟二?步驟七進(jìn)行操作，得到下一個(gè)待測(cè)聚焦區(qū)域的形態(tài)和質(zhì)譜信息；
[0022]步驟九、重復(fù)步驟八直到被測(cè)樣品上的所有待測(cè)點(diǎn)均被測(cè)到，然后利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理即可得到被測(cè)樣品形態(tài)信息和質(zhì)譜信息。
[0023]本發(fā)明高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟一可以為使平行光束通過矢量光束發(fā)生系統(tǒng)、分光鏡和光瞳濾波器后整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束再經(jīng)中孔反射鏡反射進(jìn)入中孔測(cè)量物鏡并聚焦到被測(cè)樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽。
[0024]本發(fā)明高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟四可以為計(jì)算機(jī)依據(jù)共焦軸向強(qiáng)度曲線最大值M對(duì)應(yīng)的位置zB值來控制軸向物鏡掃描器使中孔測(cè)量物鏡的聚焦光斑聚焦到被測(cè)樣品上。
[0025]本發(fā)明高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟八可以為計(jì)算機(jī)控制二維掃描振鏡系統(tǒng)使中孔測(cè)量物鏡對(duì)準(zhǔn)被測(cè)樣品的下一個(gè)待測(cè)區(qū)域，然后按步驟二?步驟七進(jìn)行操作，得到下一個(gè)待測(cè)聚焦區(qū)域的形態(tài)和質(zhì)譜信息。
[0026]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像裝置，包括激光點(diǎn)光源系統(tǒng)、沿光束行進(jìn)方向放置的準(zhǔn)直透鏡、產(chǎn)生環(huán)形光束的環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)、分光鏡、中孔反射鏡和聚焦中孔反射鏡反射光束到被測(cè)樣品的中孔測(cè)量物鏡，還包括用于探測(cè)中孔測(cè)量物鏡聚焦光斑反射光強(qiáng)度信號(hào)的集光透鏡和位于集光透鏡焦點(diǎn)的光強(qiáng)點(diǎn)探測(cè)器，以及用于探測(cè)中孔測(cè)量物鏡聚焦光斑解析電離的離子體羽組分的電離樣品吸管和質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)。
[0027]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像裝置中，包括環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)可用沿光軸方向放置的產(chǎn)生矢量光束的矢量光束發(fā)生系統(tǒng)和光瞳濾波器替代。
[0028]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像裝置中，包括激光點(diǎn)光源系統(tǒng)可以由脈沖激光器、聚焦透鏡和位于聚焦透鏡焦點(diǎn)的針孔構(gòu)成。
[0029]有益效果
[0030]本發(fā)明對(duì)比已有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0031]I)將具有高空間分辨能力的共焦顯微技術(shù)與質(zhì)譜探測(cè)技術(shù)相融合，使共焦顯微成像系統(tǒng)的光斑實(shí)現(xiàn)聚焦探測(cè)和樣品解析電離雙重功能，可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)質(zhì)譜的高空間質(zhì)譜顯微成像；
[0032]2)利用錯(cuò)位相減共焦曲線的過零點(diǎn)進(jìn)行樣品預(yù)先定焦，使最小聚焦光斑聚焦到樣品表面，可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)高空間分辨質(zhì)譜探測(cè)和微區(qū)顯微成像，有效地發(fā)揮共焦系統(tǒng)高空間分辨的潛能；
[0033]3)利用錯(cuò)位相減共焦曲線過零點(diǎn)進(jìn)行樣品預(yù)先定焦處理，可抑制現(xiàn)有質(zhì)譜儀因長(zhǎng)時(shí)間質(zhì)譜成像中聚焦光斑相對(duì)被測(cè)樣品的漂移問題；
[0034]4)利用環(huán)形光束成像既壓縮了聚焦光斑的尺寸大小，又為質(zhì)譜探測(cè)提供了結(jié)構(gòu)方面的最佳融合，可提高激光質(zhì)譜儀的空間分辨能力。
【附圖說明】
[0035]圖1為高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法示意圖；
[0036]圖2為高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法變換示意圖1 ;
[0037]圖3為高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像裝置示意圖；
[0038]圖4為實(shí)施例1和2的高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置圖；
[0039]圖5為實(shí)施例3和4的高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像裝置圖；
[0040]其中:1-平行光束、2-光強(qiáng)點(diǎn)探測(cè)器、3-環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)、4-環(huán)形光束、5-分光鏡、6-中孔反射鏡、7-中孔測(cè)量物鏡、8-被測(cè)樣品、9-等離子體羽、10-計(jì)算機(jī)、11-軸向物鏡掃描器、12-集光透鏡、13-探測(cè)針孔、14-光強(qiáng)探測(cè)器、15-共焦軸向強(qiáng)度曲線、16-移位共焦軸向強(qiáng)度曲線、17-錯(cuò)位相減共焦曲線、18-電離樣品吸管、19-質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)、20-二維工作臺(tái)、21-矢量光束發(fā)生系統(tǒng)、22-光瞳濾波器、23-環(huán)形光束、24-激光點(diǎn)光源系統(tǒng)、25-準(zhǔn)直透鏡、26-脈沖激光器、27-聚焦透鏡、28-針孔、29-出射光束衰減器、30-探測(cè)光束衰減器、31-二維掃描振鏡系統(tǒng)。
【具體實(shí)施方式】
[0041]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0042]本發(fā)明的核心方法與裝置如圖1和3所示，其中，由環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)3和中孔測(cè)量物鏡7構(gòu)成的環(huán)形光橫向超分辨系統(tǒng)，用于壓縮聚焦光斑橫向尺寸。
[0043]如圖3所示，可以由點(diǎn)光源系統(tǒng)24出射的激光經(jīng)準(zhǔn)直物鏡25準(zhǔn)直后生成圖1所示的平行光束I。
[0044]如圖2所示，可以由矢量光束發(fā)生系統(tǒng)21、光瞳濾波器22替代圖1中的環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)3，由矢量光束發(fā)生系統(tǒng)21、光瞳濾波器22和中孔測(cè)量物鏡7構(gòu)成的徑向偏振光縱向場(chǎng)緊聚焦系統(tǒng)用于壓縮聚焦光斑橫向尺寸。
[0045]以下實(shí)施例均是在圖1和3基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。
[0046]實(shí)施例1
[0047]本發(fā)明實(shí)施例基于圖4所示的高空間分辨激光共焦質(zhì)譜顯微成像裝置，包括由脈沖激光器26、聚焦透鏡27和位于聚焦透鏡27焦點(diǎn)的針孔28構(gòu)成的激光點(diǎn)光源系統(tǒng)24，沿光軸方向放置的準(zhǔn)直透鏡25、出射光束衰減器29、環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)3、分光鏡5、中孔反射鏡6和位于光軸折反方向并聚焦中孔反射鏡6反射光束到被測(cè)樣品8的中孔測(cè)量物鏡7，還包括由探測(cè)光束衰減器30、集光透鏡12、位于激光透鏡12焦點(diǎn)處的光強(qiáng)點(diǎn)探測(cè)器2構(gòu)成的共焦光強(qiáng)探測(cè)系統(tǒng)，以及用于探測(cè)中孔測(cè)量物鏡7聚焦光斑解析電離的等離子體羽9組分的電離樣品吸管18和質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)19。其中點(diǎn)探測(cè)器2可由探測(cè)針孔13和光強(qiáng)探測(cè)器14構(gòu)成。
[0048]由激光點(diǎn)光源系統(tǒng)24 (包括脈沖激光器26、聚焦透鏡27和針孔28)、準(zhǔn)直透鏡25、環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)3、分光鏡5、中孔反射鏡6、軸向物鏡掃描器11和中孔測(cè)量物鏡7構(gòu)成的激光聚焦系統(tǒng)用于產(chǎn)生超過衍射極限的微小聚焦光斑，該超衍射微小尺寸光斑具有測(cè)量樣品表面和產(chǎn)生表面等離子體的雙重功能。