高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于共焦顯微成像技術(shù)、光譜成像技術(shù)和質(zhì)譜成像技術(shù)領(lǐng)域，將激光共焦顯微成像技術(shù)、光譜成像技術(shù)與質(zhì)譜成像技術(shù)相結(jié)合，涉及一種高空間分辨激光共焦光譜一質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，可用于生物質(zhì)譜的高分辨成像。
技術(shù)背景
[0002]質(zhì)譜儀(Mass Spectrometry)是將樣品中的組分發(fā)生電離，使生成的不同荷質(zhì)比的帶電原子、分子或分子碎片在電場和磁場的作用下分別聚焦而得到按質(zhì)荷比大小順序排列的圖譜儀器。質(zhì)譜成像是對樣品二維區(qū)域內(nèi)多個微小區(qū)域分別進行質(zhì)譜分析來檢測特定質(zhì)荷比(m/z)物質(zhì)的分布。
[0003]自上世紀80年代中期基質(zhì)輔助激光解吸電離這種高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍生物質(zhì)譜成像技術(shù)的出現(xiàn)，開拓了質(zhì)譜學(xué)一個嶄新的領(lǐng)域一生物質(zhì)譜，促使質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用范圍擴展到生命科學(xué)研宄的眾多領(lǐng)域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、核酸、糖蛋白分析等方面的應(yīng)用，不僅為生命科學(xué)研宄提供了新手段，而且也促進了質(zhì)譜技術(shù)自身的發(fā)展。
[0004]但現(xiàn)有基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜儀存在以下突出問題:
[0005]I)由于利用簡單的激光聚焦來解吸電離樣品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、質(zhì)譜探測空間分辨力不高等問題；
[0006]2)無法對中性原子、分子、中離子及基團等進行探測，其結(jié)果制約了樣品質(zhì)譜成分的準確完整獲??；
[0007]3)質(zhì)譜成像所需時間長，激光質(zhì)譜儀聚焦光斑軸向位置相對被測樣品常發(fā)生漂移冋題。
[0008]而生物樣品“微區(qū)”完整組分信息的準確獲取對于生命科學(xué)研宄具有極其重要的意義。事實上，如何高靈敏地探測微區(qū)質(zhì)譜信息是目前生物質(zhì)譜領(lǐng)域亟待研宄的重要技術(shù)冋題。
[0009]實事上，強脈沖激光聚焦到樣品表面會使樣品離子化，可激發(fā)出帶電的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中離子等。如何能夠完整地獲取帶電的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中離子的信息，對于高精度分析樣品的組分具有重要意義。
[0010]利用激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)技術(shù)可測量等離子體發(fā)射光譜信息，獲得樣品中元素成分。將激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)技術(shù)與質(zhì)譜探測技術(shù)相結(jié)合，可用來彌補激光質(zhì)譜成像技術(shù)中無法獲得中性原子、分子和中離子信息的不足。
[0011 ] 激光共焦顯微鏡“點照明”和“點探測”的成像探測機制，不僅使其橫向分辨力較同等參數(shù)的光學(xué)顯微鏡改善1.4倍，而且還使共焦顯微鏡極便于與超分辨光瞳濾波技術(shù)、徑向偏振光緊聚焦技術(shù)等結(jié)合來壓縮聚焦光斑，進一步實現(xiàn)高空間分辨顯微成像。
[0012]基于此，本發(fā)明提出一種高空間分辨力的激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，其創(chuàng)新在于:首次將具有高空間分辨能力的共焦顯微技術(shù)與激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)技術(shù)和質(zhì)譜探測技術(shù)相融合，可實現(xiàn)被測樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的成像與探測。
[0013]本發(fā)明一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置可為生物質(zhì)譜高分辨成像提供一個全新的有效技術(shù)途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的是提高質(zhì)譜顯微成像技術(shù)的空間分辨力、抑制成像過程中聚焦光斑相對樣品的漂移，提出一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，以期同時獲得被測樣品成分空間信息和功能信息。本發(fā)明將激光共焦顯微鏡聚焦光斑的探測功能與激光聚焦解吸電離功能相融合，利用經(jīng)超分辨技術(shù)處理的共焦顯微鏡的微小聚焦光斑對樣品進行高空間分辨形態(tài)成像，利用質(zhì)譜探測系統(tǒng)對共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的帶電分子、原子等進行微區(qū)質(zhì)譜成像，利用光譜探測系統(tǒng)對共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的等離子體發(fā)射光譜信息進行光譜成像，然后再通過探測數(shù)據(jù)信息的融合與比對獲得完整的樣品成分信息，繼而實現(xiàn)被測樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的成像與探測。
[0015]本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0016]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法，其利用高空間分辨共焦顯微系統(tǒng)的聚焦光斑對樣品進行軸向定焦與成像，利用質(zhì)譜探測系統(tǒng)對共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的帶電分子、原子等進行微區(qū)質(zhì)譜成像，利用光譜探測系統(tǒng)對共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的等離子體發(fā)射光譜進行探測，然后再通過探測數(shù)據(jù)信息的融合與比對分析繼而實現(xiàn)被測樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的同時成像與探測，其包括以下步驟:
[0017]步驟一、使平行光束通過環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)后整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束再沿光輸出方向依次經(jīng)分光鏡、中孔分色器反射進入位于光軸折反方向的中孔測量物鏡并聚焦到被測樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽；
[0018]步驟二、使計算機控制由中孔測量物鏡、與中孔測量物鏡同軸放置的軸向物鏡掃描器、中孔分色器、分光鏡、位于分光鏡反射光方向集光透鏡和集光透鏡焦點處的光強點探測器構(gòu)成的激光共焦探測系統(tǒng)通過軸向物鏡掃描器對被測樣品進行軸向掃描測得共焦軸向強度曲線；
[0019]步驟三、將共焦軸向強度曲線沿z向平移s后得到移位共焦軸向強度曲線，然后將移位共焦軸向強度曲線與共焦軸向強度曲線相減處理得到錯位相減共焦曲線；
[0020]步驟四、將錯位相減共焦曲線的零點位置zA減去平移值s/2得(z a-s/2)，計算機依據(jù)(za-s/2)值控制軸向物鏡掃描器使中孔測量物鏡的聚焦光斑聚焦到被測樣品上；
[0021]步驟五、利用電離樣品吸管將聚焦光斑解吸電離被測樣品產(chǎn)生的等離子體羽中的分子、原子和離子吸入質(zhì)譜探測系統(tǒng)中進行質(zhì)譜成像，測得對應(yīng)聚焦光斑區(qū)域的質(zhì)譜信息;
[0022]步驟六、利用由中孔測量物鏡、軸向物鏡掃描器、中孔分色器、分光鏡、位于分光鏡反射光方向的集光透鏡和集光透鏡焦點處的光強點探測器構(gòu)成的激光共焦探測系統(tǒng)對中孔測量物鏡聚焦到被測樣品的微區(qū)進行成像，測得對應(yīng)聚焦光斑區(qū)域的形態(tài)信息；
[0023]步驟七、利用光譜探測系統(tǒng)對經(jīng)中孔分色器透射、中孔反射鏡反射和光譜收集透鏡收集的激光誘導(dǎo)擊穿光譜進行探測，測得對應(yīng)聚焦光斑區(qū)域的組分信息；
[0024]步驟八、計算機將激光共焦探測系統(tǒng)測得的激光聚焦微區(qū)的形態(tài)信息、光譜探測系統(tǒng)同時探測的激光聚焦微區(qū)的激光誘導(dǎo)擊穿光譜、質(zhì)譜探測系統(tǒng)同時探測的激光聚焦微區(qū)的質(zhì)譜信息進行融合處理，繼而得到聚焦光斑微區(qū)的形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息；
[0025]步驟九、計算機控制二維工作臺使中孔測量物鏡對準被測樣品的下一個待測區(qū)域，然后按步驟二?步驟八進行操作，得到下一個待測聚焦區(qū)域的形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息；
[0026]步驟十、重復(fù)步驟九直到被測樣品上的所有待測點均被測到，然后利用計算機進行處理即可得到被測樣品形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息。
[0027]本發(fā)明的高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟一可以為使平行光束通過沿光軸方向放置的矢量光束發(fā)生系統(tǒng)、分光鏡和光瞳濾波器后整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束再經(jīng)中孔分色器反射進入中孔測量物鏡并聚焦到被測樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽。
[0028]本發(fā)明高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟四可以為計算機依據(jù)共焦軸向強度曲線最大值M對應(yīng)的位置zB值來控制軸向物鏡掃描器使中孔測量物鏡的聚焦光斑聚焦到被測樣品上。
[0029]本發(fā)明的高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟九可為計算機控制二維掃描振鏡系統(tǒng)使中孔測量物鏡對準被測樣品的下一個待測區(qū)域，然后按步驟二?步驟八進行操作，得到下一個待測聚焦區(qū)域的形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息。
[0030]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像裝置，包括激光點光源系統(tǒng)、沿光軸方向放置的準直透鏡、環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)、分光鏡、中孔分色器和沿折轉(zhuǎn)光軸方向放置的聚焦光斑到被測樣品的中孔測量物鏡，包括用于探測中孔測量物鏡聚焦光斑反射光強度信號的集光透鏡和位于集光透鏡焦點的光強點探測器以及用于探測中孔測量物鏡聚焦光斑解析電離的等離子體羽組分的電離樣品吸管和質(zhì)譜探測系統(tǒng)，還包括探測激光誘導(dǎo)擊穿光譜的中孔分色器、位于中孔分色器透射光方向的中孔反射鏡、位于中孔反射鏡反射光方向的光譜收集透鏡和光譜收集透鏡焦點處的光譜探測系統(tǒng)。
[0031]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像裝置中，包括環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)可用沿光軸方向放置的產(chǎn)生矢量光