一種金納米粒子探針比色法檢測(cè)甲型流感病毒h3n2的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金納米粒子探針比色法檢測(cè)甲型流感病毒H3N2的方法，具體是指單克隆抗體功能化修飾到金納米粒子表面后，特異性識(shí)別甲型流感病毒H3N2并組裝到其囊膜表面，從而引起金納米粒子的表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)峰發(fā)生紅移，繼而觀測(cè)到溶液顏色變化。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒病毒，簡(jiǎn)稱(chēng)流感病毒，是一種造成人、狗、馬、豬及禽類(lèi)等患流行性感冒的RNA病毒。在世界各地，流感病毒感染是影響發(fā)病率和死亡率的一個(gè)重要因素。當(dāng)禽流感和人類(lèi)流感病毒同時(shí)感染中間宿主時(shí)，由于基因重組，極易產(chǎn)生新型流感病毒，危害社會(huì)。
[0003]傳統(tǒng)的流感病毒檢測(cè)的主要方法有病毒培養(yǎng)分離、免疫學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷。病毒分離方法經(jīng)過(guò)了很長(zhǎng)時(shí)間的考驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果更為可靠，靈敏，可以檢測(cè)出極少量病毒，但存在操作程序繁雜、費(fèi)用高、實(shí)驗(yàn)室安全級(jí)別要求高(必須在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行)，檢測(cè)時(shí)間約需I?3周，耗時(shí)較長(zhǎng)，在疫區(qū)大面積應(yīng)用推廣，大量樣品檢測(cè)方面存在較多限制條件。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要是基于抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的特性建立起來(lái)的，檢測(cè)對(duì)象主要為血清樣品。但是由于血清血凝抑制因子的干擾，可能會(huì)導(dǎo)致血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性。分子生物學(xué)診斷在近幾年得到了較快的發(fā)展，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷技術(shù)已經(jīng)成為流感實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和快速診斷的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。但由于檢測(cè)手段繁瑣，需要精密儀器，成本較高，限制了其在臨床上的應(yīng)用。
[0004]近年來(lái)除了對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的發(fā)展和完善，納米技術(shù)作為一種新興的流感病毒檢測(cè)方法，正在受到人們的更多關(guān)注。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展帶動(dòng)納米技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，有關(guān)金納米粒子在生物檢測(cè)領(lǐng)域的研宄在不斷展開(kāi)與深入，取得了豐碩的成果與長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展。金納米粒子具有獨(dú)特的光學(xué)效應(yīng)，利用金納米粒子的SPR性質(zhì)，當(dāng)抗原抗體反應(yīng)引起金納米粒子聚集形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)后，聚集體在相對(duì)較長(zhǎng)的波長(zhǎng)上對(duì)光進(jìn)行吸收和散射從而使顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色最后成為藍(lán)色。利用此光學(xué)特性的變化，結(jié)合生物分子的高靈敏度和特異性，使得金納米粒子在生物檢測(cè)上具有廣泛而重要的應(yīng)用前景。
[0005]因此開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、定量檢測(cè)臨床樣本中的流感病毒新方法對(duì)于控制流感疫情的發(fā)生和蔓延具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種金納米粒子探針比色法檢測(cè)甲型流感病毒H3N2的方法。本發(fā)明中針對(duì)金納米粒子探針在病毒囊膜表面組裝后光學(xué)性質(zhì)發(fā)生明顯變化，從而建立比色法檢測(cè)甲型流感病毒，它具有原理簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、所用原料成本較低，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果用肉眼便可直接觀測(cè)而無(wú)需任何大型儀器。
[0007]技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種金納米粒子探針比色法檢測(cè)甲型流感病毒H3N2的方法，包括以下步驟:
O單克隆抗體和甲型流感病毒的選取；
2)金納米粒子探針的合成；
3)將金納米粒子探針和甲型流感病毒作用；
4)觀察并記錄病毒溶液顏色變化情況；
5)利用紫外-可見(jiàn)光譜儀和透射電鏡對(duì)病毒溶液進(jìn)行檢測(cè)。
[0008]其中，上述單克隆抗體為甲型流感病毒H3N2血凝素鼠單克隆抗體。
[0009]其中，上述步驟2)金納米粒子探針的合成步驟如下:取一 EP管，加入0.5~1 mL，2 nmol/L金納米粒子溶液，用0.1 mo I/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.2-9.2，加入0.1 mg/mL的單克隆抗體15~30 μ L，在搖床上120~300轉(zhuǎn)/分鐘，37°C下溫育1~2小時(shí)，然后加入10-20 yL 1% (m/v)BSA，37°C下溫育 0.5~1 小時(shí)，最后將探針溶液在 12200~13200 rpm,4°C下離心20~30分鐘，離心三次后復(fù)溶在200~500 μ L PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0010]其中，上述步驟3)金納米粒子探針和甲型流感病毒作用步驟如下:取金納米粒子探針加入到甲型流感病毒溶液中，37°C下溫育1~2小時(shí)后，對(duì)其溶液進(jìn)行記錄和紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)，取5~10 y L病毒溶液滴加到碳膜支持的銅網(wǎng)上，室溫下放置1~3分鐘后，用濾紙吸去銅網(wǎng)上剩余溶液，然后將銅網(wǎng)浸于1°/『2%的磷鎢酸鈉溶液中1~3分鐘后，取出，室溫下自然晾干，透射電鏡檢測(cè)。
[0011]其中，上述PBS緩沖溶液為含有NaCl和KCl的pH 7.2-7.4的10 mmol/L的PBS緩沖溶液，所述NaCl初始濃度為136.89 mmol/L, KCl初始濃度為2.67 mmol/L。
[0012]其中，上述金納米粒子直徑為13納米。
[0013]其中，上述甲型流感病毒H3N2在緩沖溶液中的終濃度為0~400 HAU。
[0014]本發(fā)明通過(guò)一種基于表面修飾甲型流感病毒H3N2血凝素(HA)鼠單克隆抗體的金納米粒子探針特異性識(shí)別甲型流感病毒H3N2囊膜表面的血凝素，金納米粒子組裝到病毒囊膜表面，然后通過(guò)病毒囊膜表面金納米粒子的SPR性質(zhì)，比色法檢測(cè)甲型流感病毒H3N2。制備了單克隆抗體修飾的金納米粒子探針。由于每個(gè)流感病毒直徑在80~120納米，囊膜表面含有約500個(gè)血凝素，因此囊膜表面血凝素相鄰之間約為8納米，而金納米粒子的直徑為13納米，大于血凝素相鄰間距，因此病毒囊膜表面組裝的金納米粒子可以有效的產(chǎn)生SPR效應(yīng)，金納米粒子的SPR吸收峰從525納米左右紅移到600納米左右，且525納米處的SPR峰強(qiáng)度減弱，600納米處的SPR峰強(qiáng)度增加，隨著病毒濃度的增大，反應(yīng)液顏色從酒紅色逐漸變?yōu)樯钏{(lán)色。因此本發(fā)明利用單克隆抗體的特異性和金納米粒子的SPR性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)比色法檢測(cè)甲型流感病毒H3N2。
[0015]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的特色及優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明利用金納米粒子探針在甲型流感病毒囊膜表面的組裝后，溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色，顏色變化明顯，因此可用比色法檢測(cè)甲型流感病毒。
[0016](2)本發(fā)明有效利用了納米材料的特性，不需要借助精密儀器檢測(cè)，簡(jiǎn)化了檢測(cè)方法，極大地降低了病毒檢測(cè)成本，本發(fā)明具有成本低、快速、簡(jiǎn)便、敏感且特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1顯示了基于表面修飾甲型流感病毒H3N2血凝素(HA)鼠單克隆抗體的金納米粒子探針比色法檢測(cè)甲型流感病毒H3N2的流程圖；
圖2A顯示了金納米粒子的透射電鏡圖；從圖中可以看出金納米粒子粒徑均一，分散性好；圖28顯示了 a線:金納米粒子的紫外吸收光譜出線:金納米粒子探針的紫外吸收光譜；從圖中可以看出，金納米粒子探針相對(duì)金納米粒子的紫外吸收光譜沒(méi)有發(fā)生很大的變化，金納米粒子探針在緩沖溶液中性質(zhì)穩(wěn)定；
圖3A顯示了金納米粒子探針和甲型流感病毒H3N2組裝體的透射電鏡圖，標(biāo)尺為50納米；從圖中可以看出金納米粒子探針成功組裝到甲型流感病毒H3N2囊膜表面；圖3B顯示了 H3N2線:金納米粒子探針和甲型流感病毒H3N2組裝體的紫外吸收光譜control線:金納米粒子探針在緩沖溶液中的紫外吸收光譜；插圖為對(duì)應(yīng)溶液的數(shù)碼照片；從圖中可以看出，當(dāng)溶液中有甲型流感病毒H3N2時(shí)，金納米粒子探針的SPR吸收峰發(fā)生明顯紅移，對(duì)應(yīng)溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。
[0018]圖4顯示了檢測(cè)甲型流感病毒H3N2特異性的紫外光譜變化圖和柱狀圖；A:在不同探針作用下，得到的紫外光譜圖(a:金納米粒子探針與甲型流感病毒H3N2作用；b:表面修飾BSA的金納米粒子對(duì)比探針與甲型流感病毒H3N2作用；c:金納米粒子探針)，插圖為對(duì)應(yīng)溶液的數(shù)碼照片；從圖中可以看出只有單克隆抗體修飾的金納米粒子探針可以特異性識(shí)別甲型流感病毒H3N2 ;B:金納米粒子探針與不同流感病毒作用后的柱狀圖；插圖為對(duì)應(yīng)溶液的數(shù)碼照片；從圖中可以看出金納米粒