的過(guò)氧化氫和葡萄糖傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于過(guò)氧化氫和葡萄糖傳感器制備及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于親水性上轉(zhuǎn)換納米NaYFd^過(guò)氧化氫和葡萄糖傳感器的制備及其檢測(cè)方法。
技術(shù)背景
[0002]最新研宄表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫會(huì)參與很多的生理反應(yīng)并起著重要作用，如細(xì)胞增殖、分化和迀移。因此，生物體內(nèi)的過(guò)氧化氫的濃度可被當(dāng)做診斷某種疾病(帕金森氏癥，癌癥和阿爾茨海默氏病)的不同狀態(tài)的重要參數(shù)之一。
[0003]作為一個(gè)重要的生理活性物質(zhì)，葡萄糖在活細(xì)胞中幾乎全部過(guò)程中都起著關(guān)鍵作用，而適當(dāng)?shù)难菨舛炔艜?huì)對(duì)這些過(guò)程起到有利作用。所以體液中的葡萄糖水平常常用于糖尿病或低血糖的診斷。而目前用于葡萄糖檢測(cè)的方法通常涉及到以下兩個(gè)步驟一一葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫；然后過(guò)氧化氫被還原成水。因此，更加精確靈敏快速地檢測(cè)過(guò)氧化氫對(duì)血液中葡萄糖含量的檢測(cè)監(jiān)測(cè)也起著重要作用。
[0004]截至目前，已經(jīng)有多種方法被開發(fā)用于生物樣本中過(guò)氧化氫的檢測(cè)，例如分光光度法、化學(xué)發(fā)光、比色法、電化學(xué)法、細(xì)胞成像和熒光法等等。這些分析方法大多數(shù)對(duì)儀器和樣品的要求都很高，且耗時(shí)較長(zhǎng)，在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)受到一定的限制。而熒光法(Wen，F(xiàn).;Dong, Y.；Feng, L.；ffang, S.；Zhang, S.；Zhang, X.Anal.Chem.2011, 83, 1193-1196 ；Huang, X.；ffang, J.；Liu, H.；Lan, T.；Ren, J.Talanta 2013，106，79-84)在一定程度上可以避開這些缺點(diǎn)，成為用于在活細(xì)胞、血清、組織和整個(gè)動(dòng)物活體中實(shí)時(shí)檢測(cè)過(guò)氧化氫濃度的最優(yōu)方法。但是大多數(shù)有機(jī)熒光探針?lè)肿铀苄远疾缓?，且其熒光壽命短，穩(wěn)定性差，在實(shí)際樣品的檢測(cè)中仍然存在一定的局限性。近些年的研宄結(jié)果顯示，上轉(zhuǎn)換納米顆粒具有無(wú)自發(fā)熒光、無(wú)漂白、靈敏度高、對(duì)樣品損傷低等優(yōu)點(diǎn)；加上近紅外光在組織中的穿透深度更深這一優(yōu)勢(shì)，使上轉(zhuǎn)換納米顆?？梢愿玫乇粦?yīng)用于體內(nèi)檢測(cè)、生物成像、甚至體內(nèi)治療。為了進(jìn)一步研宄其在過(guò)氧化氫和葡萄糖傳感器領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單的基于稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料過(guò)氧化氫和葡萄糖傳感器，達(dá)到水溶性好、高靈敏度、高選擇性、快速且低成本的檢測(cè)目的，是本發(fā)明的意義和重點(diǎn)所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于親水性上轉(zhuǎn)換納米NaYF4的過(guò)氧化氫和葡萄糖傳感器的制備及其檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)高靈敏、高選擇性和低成本檢測(cè)過(guò)氧化氫和葡萄糖。
[0006]本發(fā)明所述的基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器的制備方法為:
[0007]a.將2.0-16.0mg的氫氧化鈉加入5_15mL去離子水中，超聲促使其完全溶解；
[0008]b.在1.5mL離心管中加入濃度為0.1-1.0mg/mL的油胺修飾的聚琥珀酰亞胺高分子溶液150-400 μ L以及濃度為0.1-0.5mmol/mL的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒分散液100-300 μ L，用氯仿將混合液定溶至0.5-1.5mL ;所述的油胺修飾的聚琥泊酰亞胺高分子溶液和稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒分散液均以氯仿為溶劑；
[0009]c.將步驟b得到的混合液加入步驟a配制的溶液中，在冰水浴下用超聲破碎粉碎儀超聲5-10min，最終得到水包油微乳液，超聲功率為200-400W ;然后在200-400rpm磁力攪拌條件下，45-60°C水浴中常壓揮發(fā)去除溶液中的氯仿；
[0010]d.將步驟c得到的溶液在10000-12000rpm速率下離心10_30min，得到的沉淀分散在1.0-4.0mL超純水中，即得到親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒分散液；
[0011]e.取50.0-200.0 yL親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒分散液、25.0-200.0 yL濃度為5.0-50.0mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液、25.0-100.0yL濃度為0.5-5.0mg/mL的辣根過(guò)氧化物酶溶液混合均勻，即得基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器溶液。
[0012]步驟b所述的油胺修飾的聚琥珀酰亞胺高分子中聚琥珀酰亞胺高分子的單體與油胺的摩爾比為1-9，聚琥珀酰亞胺高分子的分子量為5000-7000。
[0013]步驟b所述的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒為NaYF4:Yb3+，Er3+;其中Yb的摩爾摻雜量為10-18%, Er的摩爾摻雜量為2-10% ;所述的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的表面包覆有油酸，其粒徑為 15-25nm。
[0014]將上述制備的基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器應(yīng)用于過(guò)氧化氫的檢測(cè)。
[0015]將上述制備的基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器應(yīng)用于葡萄糖的檢測(cè)。
[0016]基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器檢測(cè)過(guò)氧化氫的步驟為:
[0017]a.配制過(guò)氧化氫溶液；
[0018]b.將上述制備的基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器溶液加入過(guò)氧化氫溶液中，再加入緩沖溶液，常溫下混合均勻后進(jìn)行光譜測(cè)試；
[0019]c.固定激發(fā)光波長(zhǎng)為980nm，收集400-700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜圖。
[0020]基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器檢測(cè)葡萄糖的步驟為:
[0021]a.分別配制葡萄糖氧化酶及葡萄糖溶液；
[0022]b.將葡萄糖與葡萄糖氧化酶溶液混合，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-30min，最終形成葡萄糖氧化酶-葡萄糖溶液；
[0023]c.將上述制備的基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器溶液加入葡萄糖氧化酶-葡萄糖溶液中，再加入緩沖溶液，常溫下混合均勻后進(jìn)行光譜測(cè)試；
[0024]d.固定激發(fā)光波長(zhǎng)為980nm，收集400_700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜圖。
[0025]本發(fā)明采用超聲微乳法，利用油胺修飾的聚琥珀酰亞胺高分子與上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面的油酸之間的疏水-疏水作用，以及聚琥珀酰亞胺高分子在堿性條件下部分鏈單元水解形成親水性基團(tuán)，從而在兩親體系下制得了水溶性好且穩(wěn)定的大小均一的單分散上轉(zhuǎn)換納米顆粒。將上轉(zhuǎn)換納米顆粒與四甲基聯(lián)苯胺、辣根過(guò)氧化物酶混合即可得到過(guò)氧化氫和葡萄糖傳感器，傳感器溶液需現(xiàn)用現(xiàn)制。在過(guò)氧化氫存在的條件下，辣根過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫將四甲基聯(lián)苯胺氧化，所得的氧化產(chǎn)物能夠吸收上轉(zhuǎn)換納米顆粒發(fā)出的熒光，即在熒光光譜上表現(xiàn)為上轉(zhuǎn)換納米顆粒熒光淬滅，可以通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，達(dá)到定性定量檢測(cè)過(guò)氧化氫的目的。葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下能生成過(guò)氧化氫，因此借助葡萄糖氧化酶的作用，本發(fā)明的傳感器通過(guò)間接檢測(cè)生成的過(guò)氧化氫也可實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的定性定量檢測(cè)。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比較，該方法背景干擾小，信號(hào)強(qiáng)，成本低，且具有快速準(zhǔn)確，高靈敏，高選擇性的特點(diǎn)。本發(fā)明可為今后活體微環(huán)境中過(guò)氧化氫和葡萄糖的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供新的機(jī)會(huì)。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為實(shí)施例1及實(shí)施例2中的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的TEM圖；
[0027]圖2為實(shí)施例1及實(shí)施例2中制備的基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器的TEM照片；
[0028]圖3為實(shí)施例1過(guò)氧化氫、四甲基聯(lián)苯胺、辣根過(guò)氧化物酶混合溶液與稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒光譜重疊圖:過(guò)氧化氫、四甲基聯(lián)苯胺、辣根過(guò)氧化物酶混合溶液的吸收光譜(al)，加入過(guò)氧化氫(20 μ M)之前(a2)和之后(a3)親水性上轉(zhuǎn)換納米NaYF4、過(guò)氧化氫、四甲基聯(lián)苯胺、辣根過(guò)氧化物酶混合溶液的熒光光譜；
[0029]圖4為實(shí)施例1中pH值對(duì)基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器的影響關(guān)系圖；
[0030]圖5為實(shí)施例1中不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器的熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0031]圖6為實(shí)施例1干擾離子對(duì)過(guò)氧化氫檢測(cè)(傳感器的熒光強(qiáng)度變化)的影響；
[0032]圖7為實(shí)施例2中不同濃度葡萄糖對(duì)基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器的熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0033]圖8為基于親水性上轉(zhuǎn)換納米顆粒的傳感器檢測(cè)過(guò)氧化氫和葡萄糖的原理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1:
[0035]a.將4.0mg的氫氧化鈉加入1mL去離子水中，超聲促使其完全溶解；
[0036]b.在1.5mL離心管中加入濃度為0.365mg/mL的油胺修飾的聚琥泊酰亞胺高分子溶液200 μ L以及濃度為0.25mmol/mL的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒分散液200 μ L，用氯仿將混合液定溶至ImL ;所述的油胺修飾的聚琥珀酰亞胺高分子溶液和稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒分散液均以氯仿為溶劑；
[0037]c.將步驟b中所得的混合液加入步驟a配制的溶液中，在冰水浴下用超聲破碎粉碎儀超聲6min，最終得到水包油微乳液，超聲功率為200W ;然后在300rpm磁力攪拌條件下，52°C水浴中常壓揮發(fā)去除溶液中的氯仿；
[0038]d.將步驟c得到的溶液在12000rpm速率下離心15min，得到