一種檢測(cè)人附睪分泌蛋白4的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中的一種檢測(cè)人附睪分泌蛋白4的酶聯(lián)免疫 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌而 列居第二位，由于其發(fā)病隱匿，難被早期發(fā)現(xiàn)，預(yù)后兇險(xiǎn)，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首。現(xiàn)階 段的篩查方法主要有婦科檢查、腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué)檢查等。通過腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行的血清 學(xué)診斷檢測(cè)簡便且無創(chuàng)，而且較之影像學(xué)可明顯前移卵巢癌診斷窗口期，在腫瘤的篩查、診 斷、指導(dǎo)治療、估計(jì)預(yù)后等方面有著非常廣泛的運(yùn)用前景。
[0003] 就卵巢癌而言，目前只有癌抗原125 (CA125)檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于臨床卵巢癌的診 斷。大量的研究表明，CA125水平的升降與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及消退有關(guān)。但是，CA125 在檢測(cè)卵巢癌時(shí)仍有不足：首先，假陽性率高，在其他癌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎癥等 婦科良性疾病及生理?xiàng)l件下（如月經(jīng)、妊娠）中也可出現(xiàn)陽性表達(dá)；其次，I期卵巢癌僅有 50% -60%的患者CA125值升高，單用CA125診斷陽性率〈10%，聯(lián)合其他檢測(cè)手段如聯(lián)合 超聲，也只可將陽性診斷率提高到20%，因此，需要一種靈敏性和特異性較強(qiáng)的標(biāo)志物來提 高卵巢癌的診斷水平。
[0004] 人附睪分泌蛋白 4 (human epididymis protein4, HE4,又名 WFDC2)，其基因的 cDNA 最早由Kiehhof等首先從附睪的上皮遠(yuǎn)端分離出來，其編碼的蛋白質(zhì)主要由WAP類型的4 個(gè)二硫鍵核心（WFDC)組成。2003年，Hellstrom等人比較卵巢癌患者及正常人血清中的 HE4蛋白含量，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)卵巢癌患者血清中的HE4蛋白量明顯提高，而正常組織及良性疾 病中含量很低，確定HE4作為一個(gè)潛在血清腫瘤標(biāo)記物來鑒別卵巢癌。2008年，Moore等人 的出HE4診斷卵巢癌的敏感性高達(dá)72. 9%、特異性達(dá)95%的結(jié)論，無論在特異性還是敏感 性都明顯優(yōu)于CA125。目前，國外已經(jīng)有HE4診斷試劑盒應(yīng)用于卵巢癌的早期診斷和病程監(jiān) 測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)和擴(kuò)展其應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、低成本的人HE4雙抗夾心法 檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒包括特異性的HE4包被抗體，酶標(biāo)HE4檢測(cè)抗體以及 人HE4蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0007] 其中所述HE4包被抗體為單克隆抗體，所述酶標(biāo)HE4檢測(cè)抗體為單克隆抗體或多 克隆抗體，所述單克隆抗體可以為鼠源或兔源抗體，所述多克隆抗體可以為兔源、羊源、馬 源抗體，所述包被用單克隆抗體優(yōu)選為鼠單克隆抗體，其輕鏈和重鏈氨基酸序列分別為SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2,所述酶標(biāo)檢測(cè)抗體優(yōu)選為兔多克隆抗體。所述人HE4蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 為人293細(xì)胞表達(dá)的具有生物活性的重組人HE4蛋白。
[0008] 所述單克隆抗體采用重組人HE4蛋白免疫動(dòng)物，利用雜交瘤技術(shù)制備獲得。所述 多克隆抗體采用重組人HE4蛋白免疫動(dòng)物，通過蛋白A純化和抗原親和純化技術(shù)制備獲得。 酶標(biāo)抗體按照常規(guī)方法利用辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記抗體獲 得。所述重組人HE4蛋白是經(jīng)人293細(xì)胞表達(dá)后純化獲得。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案為優(yōu)選具有高靈敏度、高特異性的單克隆抗體與酶標(biāo)多克隆抗 體配對(duì)組合，將單克隆抗體作為包被抗體吸附于固相載體上，包被抗體可以特異性的捕獲 樣本中的HE4以及HE4蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入酶標(biāo)檢測(cè)抗體后，形成包被抗體、抗原、檢測(cè)抗體復(fù) 合物，相應(yīng)底物顯色后終止，讀取樣本吸光值，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出HE4的含量。 [0010] 本發(fā)明采用雙抗夾心法定量或定性檢測(cè)樣本中的HE4水平，檢驗(yàn)方法方便易行， 檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、能夠同時(shí)快速檢測(cè)大批樣本，制備抗體所需免疫原和篩 選抗原以及試劑盒中的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品全部采用具有生物活性的重組人HE4蛋白，試劑盒主要 組成部分的抗體和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品均為自主研發(fā)，因此成本低，可靠性強(qiáng)，預(yù)計(jì)將在HE4相關(guān)基 礎(chǔ)和臨床研究中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0011] 圖1重組人附睪分泌蛋白4電泳鑒定圖
[0012] 圖2人附睪分泌蛋白4酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述和說明。
[0014] 實(shí)施例1酶聯(lián)免疫試劑盒的組分制備
[0015] 1.人HE4蛋白小鼠單克隆抗體的制備：
[0016] 1)動(dòng)物免疫
[0017] 采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以北京義翹神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的具有 生物學(xué)活性的重組人HE4蛋白為免疫原，免疫劑量為50 μ g/只，首次免疫將免疫原與等量 的完全弗氏佐劑制成乳化劑，腹部皮下多點(diǎn)注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原與等量不 完全弗氏佐劑制成乳化劑，加強(qiáng)免疫兩次，三次免疫后測(cè)定血清效價(jià)，取血清效價(jià)高的小鼠 腹腔加強(qiáng)免疫一次，4天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0018] 2)細(xì)胞融合和克隆化
[0019] 取免疫小鼠脾細(xì)胞，按4 :1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，利用聚乙二醇法進(jìn)行融 合，獲得雜交瘤細(xì)胞。采用重組人HE4蛋白作為包被抗原，用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液，選 取陽性孔通過有限稀釋進(jìn)行克隆化，直至得到穩(wěn)定分泌TNF特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞株。
[0020] 3)單克隆抗體的生產(chǎn)與純化
[0021] 選取雜交瘤細(xì)胞株，利用培養(yǎng)瓶或生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清， 利用蛋白A進(jìn)行親和純化，鑒定抗體純度和濃度后分裝，于-20°C低溫保存。
[0022] 4)單克隆抗體的序列測(cè)定
[0023] 收集培養(yǎng)的細(xì)胞，按照說明書（Invitrogen)加入TRIzol，提取總RNA，電泳檢測(cè) RNA質(zhì)量，UV測(cè)定濃度。按Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)為cDNA，-20°C凍存?zhèn)溆?。?考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板分別PCR獲得抗體的輕鏈和重鏈片段。將輕鏈和重鏈片段 TA到可用于真核細(xì)胞表達(dá)的pCDNA3T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆，測(cè)序鑒定。分 析測(cè)序結(jié)果，獲得正確的輕鏈和重鏈氨基酸序列SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2。
[0024] 2.人HE4蛋白兔多克隆抗體的制備：
[0025] 采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以重組人HE4蛋白為免疫原，免疫劑量為 500 μ g/只，首次免疫將免疫原與等量的完全弗氏佐劑制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射， 間隔2-3周取相同劑量免疫原與等量不完全弗氏佐劑制成乳化劑，加強(qiáng)免疫一次，共免疫 四次，測(cè)定血清效價(jià)，心臟取血，經(jīng)蛋白A和HE4蛋白抗原親和純化后得到純化的多克隆抗 體。
[0026] 3.酶標(biāo)抗體的制備：
[0027] 1)稱取5mg HRP溶解于0. 5ml蒸餾水中。
[0028] 2)于上液中加入0. 5ml新配的0.1 M NaKM溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
[0029] 3)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)ImM的醋酸鈉緩沖液（pH4. 4)透析，4°C過夜。
[0030] 4)加0· 2M碳酸鹽緩沖液（ρΗ9· 5)，使以上醛化HRP的pH升高到9. 0~9. 5,然后 立即加入5mg IgG在ImlO. OlM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕