一種檢測人腎損傷分子的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中的一種檢測人腎損傷分子的酶聯(lián)免疫試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] Iehimura 等于 1998 年米用表象差異分析（rep-resentational differenee analysis，RDA)在缺血一再灌注大鼠腎細胞中識別一種新的I型跨膜蛋白，命名為腎損傷 分子一 l(kidney injury molecule - 1，KIM-1)，其大量表達于缺血一再灌注損傷后再生 的近曲小管上皮細胞，而在正常腎組織中表達甚微。人類KM-I基因定位于第5號染色體 長臂（5q33. 2)，KM-I蛋白由334個氨基酸殘基組成，蛋白結(jié)構(gòu)表明，KM-I可能屬于免疫 球蛋白超家族，其胞外區(qū)包括1個信號肽、1個Ig域和1個粘蛋白域，執(zhí)行膜受體/粘附分 子的功能。KIM-I胞內(nèi)區(qū)較短。含一個保守的酪氨酸磷酸化位點，可能為轉(zhuǎn)導受體一配體相 互作用的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。KM-I的表達具有極高的組織特異性。RNA印跡雜交分析 表明，KIM-I在胎肝、胎腎中不表達，在正常成人肝、腎、脾有微弱表達，而在缺血損傷后的腎 組織中表達顯著增強。免疫組織化學染色及RNA原位雜交顯示，KIM-ImRNA及蛋白分子表 達于外髓部外層及皮質(zhì)髓射線的近曲小管S3區(qū)再生上皮細胞中，亞細胞定位大多在基底 膜細胞頂部。KIM-I的生物學功能，可能參與腎臟疾病的損傷及修復過程、對抗損傷性粘附 與免疫反應過程。
[0003] KM-I在臨床上可作為檢測急性腎損傷的靈敏、特異、定量的生物學標記物：急性 腎損傷（acute kidney injury，AKI)是涉及多學科的一種常見病癥，早期發(fā)現(xiàn)和及時治療 可防止病情進一步惡化，阻止其發(fā)展成腎衰竭。既往傳統(tǒng)的血肌酐、尿素氮等指標無法滿足 AKI的臨床早期診斷需要。KIM - 1被認為AKI的標志物之一，KM - 1是一種新的I型跨 膜糖蛋白，在正常的腎組織中幾乎不表達，但在缺血、腎毒性等所致的AKI的腎小管上皮細 胞呈高表達，其細胞外域在金屬基質(zhì)蛋白酶（matrixmetallopr-oteinases，MMP)的作用下 可裂解為可溶性片段釋放到細胞外，并排入尿中。動物研究表明，尿KIM - 1的升高早于血 肌酐、尿素氮、尿蛋白等指標，當人類發(fā)生AKI時，尿KM-I升高也較明顯，但KM - 1能否 最終被廣大的臨床醫(yī)生所公認并成為早期確診AKI的靈敏指標，還需在進一步的臨床研究 中得到證實。
[0004] KM-I還可用于腎腫瘤的早期診斷。已有報道表明，可溶性KM-I的粘蛋白域可對 抗粘附，起細胞保護作用，腫瘤細胞上的粘蛋白過度表達，也可抑制淋巴細胞與腫瘤細胞的 粘附，從而保護腫瘤細胞，使其轉(zhuǎn)移成為可能。腎細胞癌細胞株769-P能大量表達KIM-1， 腎細胞癌患者腎活檢標本通過免疫組化顯示，同樣高度表達KIM-1，而在腎切除術(shù)后，尿 KM-I水平迅速下降或消失，表明KM-I及其可溶性成分可能在腎腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起 作用，可作為腎腫瘤的早期診斷指標。
[0005] 基于KM-I在臨床研究和輔助診斷中可能具有的重要作用，準確測定不同尿液樣 本中的KIM-I水平對于基礎及臨床研究均具有重要的意義。酶聯(lián)免疫法由于檢測設備要求 低，易于實現(xiàn)快速高通量，定量較為準確，因此是目前測定KM-I的主要手段，本發(fā)明完全 自主開發(fā)出了針對KM-I不同位點的新型鼠抗KM-I單克隆抗體，采用雙抗夾心法組成了 KIM-I檢測試劑盒，可以被廣泛應用于KIM-I的基礎及臨床研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測靈敏度高、準確性強、低成本的人KIM-I雙抗夾心 法檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明所提供的檢測試劑盒包括特異性的KM-I包被抗體，酶標KM-I檢測抗體 以及人KIM-I蛋白標準品。
[0008] 其中所述KM-I包被抗體和檢測抗體皆為鼠源單克隆抗體，所述人KM-I蛋白標 準品為真核表達的重組人KM-I蛋白。
[0009] 所述單克隆抗體采用重組人KM-I蛋白免疫動物，利用雜交瘤技術(shù)制備獲得。酶 標抗體按照常規(guī)方法利用辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP)標記抗體獲得。 所述重組人KIM-I蛋白是真核表達后純化獲得。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案為優(yōu)選針對KIM-I不同表位，具有高靈敏度、高特異性的單克 隆抗體配對組合，將一株單克隆抗體作為包被抗體吸附于固相載體上，包被抗體可以特異 性的捕獲樣本中的KM-I以及KM-I蛋白標準品，加入酶標檢測抗體后，形成包被抗體、抗 原、檢測抗體復合物，相應底物顯色后終止，讀取樣本吸光值，通過與標準曲線比較即可得 出KM-I的含量。
[0011] 本發(fā)明采用雙抗夾心法定量或定性檢測樣本中的KIM-I水平，檢驗方法方便易 行，檢測靈敏度和準確度高、特異性強、能夠同時快速檢測大批樣本，制備抗體所需免疫原 和篩選抗原以及試劑盒中的蛋白標準品全部采用重組人KIM-I蛋白，試劑盒主要組成部分 的抗體和蛋白標準品均為自主研發(fā)，因此成本低，可靠性強，預計將在KIM-I相關(guān)基礎和臨 床研究中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0012] 圖1重組人KM-I蛋白標準品電泳鑒定圖
[0013] 圖2人KIM-I酶聯(lián)免疫試劑盒檢測標準曲線圖
【具體實施方式】
[0014] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述和說明。
[0015] 實施例1酶聯(lián)免疫試劑盒的組分制備
[0016] 1.人KM-I蛋白小鼠單克隆抗體的制備：
[0017] 1)動物免疫
[0018] 采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以義翹神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的重組人 KM-I蛋白為免疫原，免疫劑量為SOyg/只，首次免疫將免疫原與等量的完全弗氏佐劑制 成乳化劑，腹部皮下多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原與等量不完全弗氏佐劑制成 乳化劑，加強免疫兩次，三次免疫后測定血清效價，取血清效價高的小鼠腹腔加強免疫一 次，4天后取脾細胞進行融合。
[0019] 2)細胞融合和克隆化
[0020] 取免疫小鼠脾細胞，按4 : 1比例與SP2/0骨髓瘤細胞混合，利用聚乙二醇法進行 融合，獲得雜交瘤細胞。采用重組人KM-I蛋白作為包被抗原，用ELISA法測定細胞上清液， 選取陽性孔通過有限稀釋進行克隆化，直至得到穩(wěn)定分泌KIM-I特異性單克隆抗體的雜交 瘤細胞株。
[0021] 3)單克隆抗體的生產(chǎn)與純化
[0022] 選取雜交瘤細胞株，利用培養(yǎng)瓶或生物反應器進行細胞培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清， 利用蛋白A進行親和純化，鑒定抗體純度和濃度后分裝，于_20°C低溫保存。
[0023] 2.酶標抗體的制備：
[0024] 1)稱取5mg HRP溶解于0. 5ml蒸餾水中。
[0025] 2)于上液中加入0. 5ml新配的0.1 M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
[0026] 3)將上述溶液裝入透析袋中，對ImM的醋酸鈉緩沖液（pH4. 4)透析，4°C過夜
[0027] 4)加0· 2M碳酸鹽緩沖液（ρΗ9· 5)，使以上醛化HRP的pH升高到9. 0~9. 5,然后 立即加入5mg IgG在ImlO. OlM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
[0028] 5)加 0.