)
[0128] 此處，乂為阿伏伽德羅數(shù)。因此，當信號數(shù)到達預(yù)先決定的數(shù)XE需要的時間為T 時，粒子濃度C根據(jù)
[0129] C = XEASTuNa)…（11)
[0130] 作為時間T的函數(shù)而獲得。需要說明的是，式（11)中，每單位時間的粒子的檢測 速度V根據(jù)信號數(shù)達到預(yù)先決定的數(shù)XE所需要的時間T和粒子檢測數(shù)XE，由下式而獲得，
[0131] V = XE/T…（12)
[0132] 所以粒子濃度C表示為
[0133] C = VASuNa)…（13)
[0134] 該式（13)中，粒子濃度C與檢測速度V成一次比例，粒子濃度C與檢測速度V的 對應(yīng)關(guān)系容易理解，所以在實際的實驗中，粒子濃度C也可以使用檢測速度V確定。
[0135] (ii)處理操作次序
[0136] 檢測一定的信號數(shù)的單一粒子檢測處理也可以例如按照圖5的流程圖所示的處 理次序?qū)嵭?。同圖的例中，簡單地說，每隔解析時間間隔t (規(guī)定的時間間隔）反復(fù)實施光檢 測區(qū)域位置的移動、來自光檢測區(qū)域的光的檢測、單一粒子的信號的檢測以及檢測到的粒 子信號的計數(shù)的一連串處理，直至檢測到的粒子數(shù)X到達結(jié)束粒子數(shù)XE (發(fā)光粒子數(shù)所應(yīng) 到達的預(yù)先決定的數(shù)）為止。需要說明的是，應(yīng)該理解為，以下所述的一連串處理和構(gòu)成， 通過計算機18的處理操作而實現(xiàn)。
[0137] (a)初始設(shè)置
[0138] 參照圖5,在操作處理中，具體地，首先，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置 于顯微鏡的平臺上之后，使用者對計算機18輸入光強度的測定和粒子的檢測?計數(shù)的處理 開始的指示時，計算機18進行結(jié)束粒子數(shù)XE的設(shè)定（步驟10)以及解析時間間隔t的設(shè) 定（步驟20)作為初始設(shè)置。結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時間間隔t也可以由使用者任意地設(shè) 定。為了達到粒子濃度的結(jié)果值所要求的精度，可以使用粒子濃度已知的溶液進行預(yù)實驗， 參考預(yù)實驗的結(jié)果而適宜確定結(jié)束粒子數(shù)XE。作為解析時間間隔t，充分短于由處理開始 后至粒子數(shù)（X)到達結(jié)束粒子數(shù)（XE)為止的時間的任意的時間間隔，也可以考慮裝置1中 的處理速度等而適宜設(shè)定。另外，關(guān)于結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時間間隔t，分別參考使用了粒 子濃度已知的溶液的預(yù)實驗的結(jié)果而預(yù)先決定的值被存儲于裝置1中，所述存儲的值可以 通過自動選擇或者通過使用者的選擇而使用。
[0139] (b)粒子數(shù)的檢測
[0140] 如上所述進行結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時間間隔t的設(shè)定時，可以如下所述反復(fù)實施 以下的步驟：每隔解析時間間隔t，利用經(jīng)過解析時間間隔t的掃描分子計數(shù)法進行光強度 的測定處理和由測定的光強度數(shù)據(jù)進行粒子信號的檢測以及粒子數(shù)X的檢測（步驟30); 累積步驟30中檢測到的粒子數(shù)X計算粒子的總數(shù)X (tn)的處理（步驟40)，直至粒子的總數(shù) X(tn)達到結(jié)束粒子數(shù)XE為止（步驟50)。需要說明的是，也可以先于反復(fù)實施步驟30~ 50的處理存儲一系列處理的開始時間Ts (步驟25)。
[0141] 步驟30中的光檢測?粒子數(shù)檢測的處理也可以與圖3所示的處理同樣。簡單地 說，邊進行光檢測區(qū)域位置在試樣溶液內(nèi)的移動（試樣溶液內(nèi)的掃描）邊經(jīng)過解析時間間 隔t進行光強度的測定，之后，在得到的解析時間間隔t中的按照時間順序的光強度數(shù)據(jù) 中，在計算機18中，根據(jù)存儲于存儲裝置的程序進行處理，實施表示單一粒子存在的信號 的檢測以及檢測數(shù)的計數(shù)。
[0142] 這樣，如果檢測到經(jīng)過解析時間間隔t的按照時間順序的光強度數(shù)據(jù)中的粒子數(shù) X，則發(fā)光粒子的檢測總數(shù)X(tn)通過下式算出（圖5-步驟40)。
[0143] X(tn) = X (V1)+X··· (14)
[0144] 需要說明的是，X(tn_i)為至前次的解析時間間隔t為止檢測到的粒子的檢測總 數(shù)，其初始值為0。接著，步驟30~40在發(fā)光粒子的檢測總數(shù)X (tn)達到結(jié)束粒子數(shù)XE為 止即，
[0145] X (tn)彡 XE…（15)
[0146] 成立為止（步驟50)，每隔解析時間間隔t重復(fù)一次。并且，反復(fù)進行步驟30~ 50期間，當式（15)成立時，試樣溶液的光強度的測定與粒子的檢測?計數(shù)的處理結(jié)束。也 可以當步驟30~50的反復(fù)處理結(jié)束時，存儲結(jié)束時間TE(步驟60)。
[0147] (c)粒子數(shù)與測定結(jié)束時間的顯示
[0148] 然而，每隔解析時間間隔t反復(fù)實施步驟30~50期間（直至式（15)成立為止）， 計算機18的監(jiān)視器上等顯示器顯示粒子的檢測總數(shù)X (tn)和/或測定結(jié)束時間TE或者測 定剩余時間Tr。根據(jù)所述構(gòu)成，有如下優(yōu)點：使用者能夠通過看見這些顯示預(yù)測實施中的 測定何時結(jié)束。
[0149] 如上所述實施顯示的情況下，圖5的步驟50的判定中，當式（15)不成立時，實施 圖中虛線所示的各處理。具體而言，首先，在顯示器上顯示步驟40中計算的最新的粒子的 檢測總數(shù)X (tn)(步驟52)。需要說明的是，已經(jīng)反復(fù)實施了步驟30~50的情況下，到目前 為止的粒子的檢測總數(shù)X(t n)的值被更新。接著，為了計算出測定結(jié)束時間TE或者測定剩 余時間Tr，計算出步驟30~50的處理開始后的粒子的檢測速度V (步驟54)。目前為止的 粒子的檢測速度V通過下式而獲得。
[0150] V = X(tnV(Tp-Ts)... (16)
[0151] 此處，Tp為現(xiàn)在的時刻。這樣，可以使用粒子的檢測速度V通過下式推定測定剩余 時間Tr (直至步驟30~50的處理結(jié)束為止的時間）
[0152] Tr = (XE-X(tn))/v- (17)
[0153] 另外，測定結(jié)束時間TE (步驟30~50的處理結(jié)束的時間）通過下式推測（步驟 56) ο
[0154] TE = Tp+Tr... (18)
[0155] 接著，在顯示器上顯示推定的測定結(jié)束時間TE或者測定剩余時間Tr (步驟58)。需 要說明的是，當已經(jīng)反復(fù)實施步驟30~50的情況下，已經(jīng)顯示的值被更新。另外，當X(tn) =0時，式（17)或（18)沒有被運算而Tr和TE也可以顯示為不明。
[0156] 如上所述，每隔解析時間間隔t重復(fù)上述圖5的步驟30~50的處理。關(guān)于這一 點，圖3的步驟100的光強度的測定也可以從測定的開始至結(jié)束為止在步驟100以外的信 號處理步驟的實施中也連續(xù)地實施。即，在光檢測·粒子數(shù)檢測的處理中，當一次循環(huán)的經(jīng) 過解析時間間隔t的光強度的測定結(jié)束時，直接連續(xù)地實施下一循環(huán)的經(jīng)過解析時間間隔 t的光強度的測定，與此同時，在計算機18中，由結(jié)束的循環(huán)的經(jīng)過解析時間間隔t而取得 的光強度數(shù)據(jù)實施粒子的信號檢測?計數(shù)的處理。由此，實時地實現(xiàn)粒子的檢測·計數(shù)。
[0157] (d)濃度計算等分析
[0158] 這樣，當粒子數(shù)到達結(jié)束粒子數(shù)時，也可以使用粒子數(shù)到達結(jié)束粒子數(shù)為止的時 間T( = TE-Ts)或者由檢測到的粒子信號得到的其他的信息，實施濃度計算等的分析（步 驟70)。如上所述，使用式（12)，由到達結(jié)束粒子數(shù)為止的時間T和結(jié)束粒子數(shù)ΧΕ，計算粒 子的檢測速度V ;由粒子的檢測速度V使用式（13)的關(guān)系確定粒子濃度。
[0159] 需要說明的是，式（10)~（13)中的光檢測區(qū)域所通過區(qū)域的截面積S理論上可 以根據(jù)激發(fā)光或檢測光的波長、鏡頭開口數(shù)、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而算出；也可以通過實 驗例如：對于粒子濃度已知的溶液（對照溶液），按照與欲檢查的試樣溶液的測定同樣的 條件，進行如上述說明的光強度的測定、粒子的檢測以及計數(shù)，根據(jù)由此檢測到的粒子的個 數(shù)、對照溶液的發(fā)光粒子的濃度而確定。具體而言，例如，對于粒子濃度為C的對照溶液，假 設(shè)以移動速度U 0經(jīng)過某時間τ 〇實施的光強度的測定中的粒子的檢測數(shù)為Ν，則光檢測區(qū) 域所通過區(qū)域的截面積S下式而獲得。
[0160] S = NAC · NA · Uo · τ 〇)…（19)
[0161] 另外，準備粒子的多個濃度不同的溶液作為對照溶液，分別對其實施測定，將計算 的S的平均值作為光檢測區(qū)域的截面積S而采用即可。
[0162] (e)試樣溶液的光強度的測定和粒子的檢測?計數(shù)處理的修正例
[0163] 上述的試樣溶液的光強度的測定、發(fā)光粒子的檢測以及計數(shù)的處理中，作為另外 的方式，解析時間間隔t并非為固定值，也可以根據(jù)發(fā)光粒子的檢測狀況進行修正。圖6A 以流程圖的形式表示包含將解析時間間隔t根據(jù)粒子的檢測狀況進行修正的處理（步驟 20'）而構(gòu)成的、試樣溶液的光強度的測定和粒子的檢測?計數(shù)的處理，圖6B以流程圖的形 式表示步驟20'中的解析時間間隔t的運算處理。需要說明的是，圖6A中，與圖5相同的 處理中，帶有同一步驟序號。
[0164] 參照同圖，圖6的處理中，每次經(jīng)過解析時間間隔t的光強度的測定結(jié)束后，解析 時間間隔t都會被修正（步驟20'）。另外，圖示的例子的處理特別構(gòu)成為：從開始起至粒 子數(shù)到達結(jié)束粒子數(shù)XE為止的一次測定中，只實施預(yù)先決定的次數(shù)N(以下，稱為"更新預(yù) 定次數(shù)"。）的、光強度的測定和粒子的檢測、計數(shù)的處理循環(huán)。具體而言，首先，作為初始 設(shè)置進行結(jié)束粒子數(shù)XE的設(shè)定（步驟10)以及開始時間Ts的存儲（步驟25)之后，最初 實施光強度的測定和粒子的檢測?計數(shù)的處理時即光強度的測定和粒子的檢測?計數(shù)的處 理循環(huán)的實施次數(shù)k為O時，對于解析時間間隔t，賦值為可以任意設(shè)定的初始值to (參照 圖6B的步驟200、210)。接著，處理循環(huán)的實施次數(shù)k增大1 (步驟270)，與圖5所述的處 理同樣地實施經(jīng)過解析時間間隔t的光強度的測定和粒子的檢測以及計數(shù)的處理（步驟 30~50)。這樣，當?shù)玫阶畛跹h(huán)的粒子數(shù)x( = XU1))時，依次計算出粒子檢測速度V(步 驟54)、測定剩余時間Tr (步驟56)。需要說明的是，也可以與圖5的情況同樣地，計算機18 的監(jiān)視器上等顯示器顯示粒子的檢測總數(shù)X(tn)和/或測定結(jié)束時間TE或者測定剩余時 間Tr (步驟52、58)。另外，在最初的處理循環(huán)中粒子數(shù)即到達結(jié)束粒子數(shù)XE時，直接結(jié)束 光強度的測定、粒子的檢測?計數(shù)的處理（步驟50)。
[0165] 最初的處理循環(huán)之后，反復(fù)進行解析時間間隔t的修正、與圖5的情況同樣的光強 度的測定和粒子的檢測?計數(shù)的處理循環(huán)（步驟20'、30~58)直至粒子數(shù)到達結(jié)束粒子 數(shù)XE為止。此時，在進行解析時間間隔t的修正的步驟20'中，首先，判斷到此時為止檢測 到的粒子數(shù)X(t n)是否為0(步驟220)。X(tn) =0時，即將開始的循環(huán)的解析時間間隔t 也可以設(shè)為m倍（m為1以上的正數(shù)）。當X(tn) >0時，使用測定剩余時間Tr、更新預(yù)定 次數(shù)N和處理循環(huán)的實施次數(shù)k，解析時間間隔t通過下式而算出（步驟240)。
[0166] t = TiV (N-k)…（20)
[0167] 需要說明的是，計算的解析時間間隔t也可以設(shè)定下限，解析時間間隔t低于下限 值tmin時，解析時間間隔t也可以設(shè)定為下限值tmin(步驟250、260)。如上所述，根據(jù)解 析時間間隔t被修正的方式，測定剩余時間Tr反映作為觀測對象的試樣溶液中的粒子的檢 測狀況，所以解析時間間隔t可以根據(jù)所述粒子的檢測狀況而最優(yōu)化。
[0168] 接著，對于利用了反轉(zhuǎn)型掃描分子計數(shù)法的、本發(fā)明的目標粒子的檢測方法進行 說明。
[0169] <目標粒子的檢測方法>
[0170] 本發(fā)明的檢測方法中，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，利用反轉(zhuǎn) 型掃描分子計數(shù)法，檢測非發(fā)光性的粒子。如前所述，反轉(zhuǎn)型掃描分子計數(shù)法在分子離散的 狀況下對于PM級以下的比較低的濃度的粒子也能進行測定。因此，通過本發(fā)明的檢測方 法，即使當試樣溶液中的解析對象的目標粒子的濃度非常低時，也能夠高靈敏度地計數(shù)目 標粒子。
[0171] 進而，本發(fā)明的檢測方法并非對作為檢測對象的目標粒子直接計數(shù)，使用具有能 夠用反轉(zhuǎn)型掃描分子計數(shù)法計數(shù)的大小的、并且能夠與目標粒子結(jié)合的觀測用粒子，從而 檢測測定試樣溶液中的觀測用粒子，由此間接地檢測目標粒子。因此，即便在目標粒子的 每一分子的大小相對于光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的體積小（即，該粒子通過前述光檢測區(qū)域 時，由該光檢測區(qū)域檢測到的光強度幾乎不降低）的情況下，能夠利用反轉(zhuǎn)型掃描分子計 數(shù)法，能夠抑制由漫射光、水的拉曼散射導(dǎo)致的影響，并且能夠不進行發(fā)光標記而檢測目標 粒子。
[0172] 具體而言，本發(fā)明的檢測方法的特征在于，具有下述工序（a)~（e)，使用共聚焦 顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測非發(fā)光性的粒子。
[0173] (a)使非發(fā)光性的觀測用粒子和固相載體通過作為檢測對象的目標粒子在溶液中 或溶液的界面結(jié)合，形成復(fù)合體的工序；
[0174] (b)在前述工序（a)之后，將前述游離狀態(tài)的觀測用粒子由前述溶液中去除的工 序；
[0175] (c)在前述工序（b)之后，使前述觀測用粒子從前述復(fù)合體分離的工序；
[0176] (d)在前述工序（C)之后，使分離的觀測用粒子分散而制備測定試樣溶液的工序； 和
[0177] (e) -邊在所述測定試樣溶液內(nèi)移動所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置，一邊檢 測從所述光檢測區(qū)域發(fā)出的實質(zhì)上包含一定背景光的光，生成按照時間順序的光強度數(shù) 據(jù)，將所述按照時間順序的光強度數(shù)據(jù)中所述觀測用粒子進入所述光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的 光強度的降低作為表示所述觀測用粒子分別存在的信號而逐個地進行檢測，從而檢測所述 測定試樣溶液中的觀測用粒子的工序。
[0178] 作為本發(fā)明的檢測方法的檢測對象的目標粒子為非發(fā)光性的粒子。非發(fā)光性是指 不通過熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的粒子。需要說明的是，目標粒子 可以是相對于背景光和測定光（利用反轉(zhuǎn)型掃描分子計數(shù)法進行測定時，為了檢測背景光 而照射測定試樣溶