用于同時(shí)檢測(cè)或定量多種目標(biāo)物質(zhì)的分析方法和分析試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于同時(shí)檢測(cè)或定量多種目標(biāo)物質(zhì)的分析方法和分析試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分析對(duì)象的技術(shù)，開(kāi)發(fā)了 BIST (Beads array In Single Tip)(非專利文獻(xiàn)1)。BIST是指，在圓筒狀的芯片（以下稱為"毛細(xì)管"）部分排列封 入有直徑Imm的探針微珠的器件。所述探針微珠固定有與抗原、基因等測(cè)定對(duì)象物質(zhì) 結(jié)合的抗體、抗原或者DNA片段等生物體分子。該BIST能夠嵌合于Magtration裝置 的噴嘴，因此能夠使用與核酸提取相同的自動(dòng)化裝置（例如，Magtration(注冊(cè)商標(biāo)） System 6GC，Magtration (注冊(cè)商標(biāo)）System 12GC Plus (Precision system Science 公司 制））來(lái)進(jìn)行雜交反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)和清洗操作。產(chǎn)生的信號(hào)可以利用掃描儀（例如， BISTnner(Precision system Science 公司制））進(jìn)行檢測(cè)。
[0003] BIST技術(shù)的最大特征在于，毛細(xì)管中配置有多個(gè)用于捕獲不同目標(biāo)物質(zhì)的探針微 珠，能夠?qū)崿F(xiàn)多項(xiàng)目的同時(shí)檢測(cè)。在應(yīng)用到甲狀腺刺激激素（TSH:thyroid stimulating hormone)、通過(guò)與其同時(shí)檢驗(yàn)而臨床上的有用性高的FT3 (Free Triiodo thyronine)、 FT4(Free thyroxine)的定量檢驗(yàn)中，實(shí)用上所要求的檢測(cè)濃度域涉及廣范圍（TSH: 0· 05-50uIu/mL，F(xiàn)T3 :0· 5-20pg/mL，F(xiàn)T4 :0· Ι-lOng/dL，以動(dòng)態(tài)范圍計(jì)為 IO3左右）。因此， 為了實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)目同時(shí)檢驗(yàn)，必須使來(lái)自各探針微珠的信號(hào)光（強(qiáng)度與目標(biāo)物質(zhì)的濃度成比 例地增加的光）局部化、并抑制與來(lái)自其他探針微珠的信號(hào)光的干渉。但是，至今為止，信 號(hào)光的局部化還不能說(shuō)是充分達(dá)到的。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005] 非專利文獻(xiàn)
[0006] 非專利文獻(xiàn)1 :遺伝子多型簡(jiǎn)易測(cè)定法CMC出版刊"月刊八彳才彳y夂只卜y - 2008年9月號(hào)"

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明要解決的課題
[0008] 為了同時(shí)檢測(cè)或定量多種目標(biāo)物質(zhì)，本發(fā)明的目的在于使來(lái)自探針微珠的信號(hào)光 局部化。
[0009] 解決課題的方法
[0010] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛深入的努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在BIST中隔著濾光器來(lái)測(cè)定來(lái)自 探針微珠的發(fā)光，能夠選擇性地接受來(lái)自所需的探針微珠的發(fā)光，并完成了本發(fā)明。
[0011] 本發(fā)明的要旨如下所述。
[0012] (1) -種分析方法，其通過(guò)收容在單一容器內(nèi)的、分別固定有用于捕獲多種目標(biāo)物 質(zhì)的物質(zhì)的多個(gè)載體發(fā)光，并從容器外部測(cè)定該發(fā)光，來(lái)同時(shí)檢測(cè)或定量多種目標(biāo)物質(zhì)，其 中，通過(guò)隔著濾光器來(lái)測(cè)定源自載體的發(fā)光，由此選擇性地接受源自所需的載體的發(fā)光。
[0013] (2)如⑴所述的方法，其中，濾光器設(shè)置于容器表面，或者容器本身為濾光器。
[0014] (3)如⑴或⑵所述的方法，其中，容器本身為濾光器。
[0015] (4)如⑴~⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用測(cè)定對(duì)象的發(fā)光的波長(zhǎng)區(qū)域中 的光線透射率為70 %以下的濾光器。
[0016] (5)如⑴~⑷中任一項(xiàng)所述的方法，其中，載體呈球狀。
[0017] (6)如⑴~（5)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，1維或2維地配置載體。
[0018] (7)如⑴~（6)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，發(fā)光為化學(xué)發(fā)光或焚光，發(fā)光的波長(zhǎng) 區(qū)域在340-900nm的范圍內(nèi)。
[0019] (8) -種分析試劑盒，其包括：分別固定有用于捕獲多種目標(biāo)物質(zhì)的物質(zhì)的多個(gè) 載體，和用于選擇性地接受源自所需的載體的發(fā)光的濾光器，所述分析試劑盒用于通過(guò)收 容在單一容器內(nèi)的、分別固定有用于捕獲多種目標(biāo)物質(zhì)的物質(zhì)的多個(gè)載體發(fā)光，并從容器 外部測(cè)定該發(fā)光，來(lái)同時(shí)檢測(cè)或定量多種目標(biāo)物質(zhì)。
[0020] (9)如（8)所述的分析試劑盒，其中，容器本身為濾光器。
[0021] (10)如⑶或（9)所述的分析試劑盒，其中，發(fā)光為化學(xué)發(fā)光或焚光，發(fā)光的波長(zhǎng) 區(qū)域在340-900nm的范圍內(nèi)。
[0022] 發(fā)明效果
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，在同時(shí)檢測(cè)或定量多種目標(biāo)物質(zhì)的體系中，能夠使源自固定有用于 捕獲目標(biāo)物質(zhì)的物質(zhì)的探針微珠的信號(hào)光局部化，并抑制與源自其他探針微珠的信號(hào)光的 干渉。
[0024] 本說(shuō)明書(shū)包括作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)日本特愿2012 - 232488的 說(shuō)明書(shū)和/或附圖中記載的內(nèi)容。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1示出BIST毛細(xì)管內(nèi)構(gòu)成。
[0026] 圖2-1(左上）示出基于BIST的TSH(0. 5uIU/mL)測(cè)定中源自位于毛細(xì)管中央部 的探針微珠的發(fā)光峰。圖2-2 (右上）示出基于BIST的TSH (25uIU/mL)測(cè)定中源自位于毛 細(xì)管中央部的探針微珠的發(fā)光峰。圖2-3(下）示出毛細(xì)管材料的吸光度與信號(hào)光峰的值 的關(guān)系。
[0027] 圖3-1 (左上）是以峰值將圖2-2的數(shù)據(jù)歸一化并用log尺度顯示縱軸的圖表。 圖3-2 (右上）示出毛細(xì)管材料的吸光度與峰寬度（縱軸為1/3, 000的寬度）的關(guān)系。圖 3-3 (下）示出毛細(xì)管材料的吸光度和峰值與峰寬度之比（P/W比）的關(guān)系（將Abs = 0. 0 時(shí)的P/W比設(shè)為1，以相對(duì)P/W比進(jìn)行繪圖）。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0029] 本發(fā)明提供一種分析方法，其通過(guò)收容在單一容器內(nèi)的、分別固定有用于捕獲多 種目標(biāo)物質(zhì)的物質(zhì)的多個(gè)載體發(fā)光，并從容器外部測(cè)定該發(fā)光，來(lái)同時(shí)檢測(cè)或定量多種目 標(biāo)物質(zhì)，其中，通過(guò)隔著濾光器來(lái)測(cè)定源自載體的發(fā)光，由此選擇性地接受源自所需的載體 的發(fā)光。
[0030] 對(duì)于容器而言，只要能夠從容器外部測(cè)定發(fā)光，則可以為任意容器，但適合具有透 光性，優(yōu)選樹(shù)脂、玻璃等透射光的材質(zhì)。另外，容器的形狀沒(méi)有特別限制，可以為細(xì)管、移液 管狀等形狀。例如，在BIST的情況下，容器為能夠進(jìn)行收容在內(nèi)部的液體的吸引、吐出的圓 筒狀芯片。
[0031] 本發(fā)明的方法中，通過(guò)提高容器的透明度，能夠降低信號(hào)光的擴(kuò)散。容器的厚度 Imm的霧度值適合為20 %以下，優(yōu)選為10 %以下，更優(yōu)選為1 %以下。作為厚度Imm的霧度 值為20%以下的容器的材質(zhì)，可例示：聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、環(huán) 狀聚烯烴、聚甲基戊烯等。
[0032] 霧度值為表示透明性的程度的值，JIS K7136中定義為擴(kuò)散透射率與總光線透射 率之比。
[0033] 另外，發(fā)光或放射的波長(zhǎng)區(qū)域中的容器的折射率適合為1.6以下，優(yōu)選為1.55以 下，更優(yōu)選為1. 50以下。作為折射率為1. 6以下的容器的材質(zhì)，可以例示：聚丙烯、聚碳酸 酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、環(huán)狀聚烯烴、聚甲基戊烯等。
[0034] 目標(biāo)物質(zhì)可以為血液、血清、尿、淋巴液、口腔內(nèi)粘膜、指甲、喀痰等生物體試樣、河 水、湖水、海水、土壌等試樣中含有的作為分析對(duì)象的物質(zhì)。作為目標(biāo)物質(zhì)，可以例示：核酸、 蛋白質(zhì)、抗原、抗體、酶、糖等生物體物質(zhì)，沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等細(xì)菌類，鈷、鐵、鉬、銅、鋅、 神、錦、I凡等金屬等。
[0035] 目標(biāo)物質(zhì)可以進(jìn)行能夠測(cè)定的標(biāo)記，作為能夠測(cè)定的標(biāo)記，可以例示：熒光標(biāo)記、 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、磁標(biāo)記等。作為標(biāo)記物質(zhì)，可以例 示：海軍藍(lán)（Marine Blue)、級(jí)聯(lián)藍(lán)（Cascade Blue)、級(jí)聯(lián)黃（Cascade Yellow)、焚光黃 (Fluorescein)、羅丹明（Rhodamine)、藻紅蛋白（Phycoerythrin)、CyChrome、PerCP、德州 紅（Texas Red)、別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin)、PharRed、俄勒閃綠（Oregon Green)_488、 Cy 系色素（例如Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy7等）、Alexa系色素（例如，Alexa-488、Alexa_532、 Alexa-546、Alexa-633、Alexa-680、Alexa-700、Alexa-750 等）、BODIPY 系色素（例如， BODIPY FL、BODIPY TR-等）等熒光物質(zhì)，魯米諾（luminol)、吖啶、金剛烷基環(huán)二氧乙烷、 草酸酯、洛芬、光澤精、異氨基苯二酰肼衍生物等化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，三聯(lián)吡啶-(4-甲基砜）NHS 醋釕（Π )絡(luò)合物、二苯基蒽、四苯基蒽等電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，P0D(Hydrogen peroxidase，過(guò)氧 化氫酶）、AP (alkaline phosphatase，堿性磷酸酶）、β半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖 氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等酶等。另外，也可使用放射性同位元素（例如， 3H、14C、32P、 33P、35S、 125I等）等放射性物質(zhì)等標(biāo)記物質(zhì)。
[0036] 目標(biāo)物質(zhì)可以被直接標(biāo)記，也可以被間接標(biāo)記。例如，后述的實(shí)施例中，使用了三 明治ELISA法。具體地，在固定于載體的一次抗體上結(jié)合作為抗原的目標(biāo)物質(zhì)后，使作為二 次抗體的生物素標(biāo)記抗體與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合。然后，在該二次抗體上結(jié)合催化化學(xué)發(fā)光的鏈 霉素抗生物素蛋白化的HRP，標(biāo)記目標(biāo)物質(zhì)。
[0037] 關(guān)于用于捕獲目標(biāo)物質(zhì)的物質(zhì)，只要為與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)，則可以例示：抗 體、抗原、DNA片段、金屬絡(luò)合物、其他低分子化合物等，但并不限定于這些。
[0038] 載體可以為無(wú)定形粒子、球（微珠）、絲（線）、磁性微珠等任意形狀，但優(yōu)選為球 狀。在載體采取球（微珠）或磁性微珠的形狀的情況下，可以在各球（微珠）或磁性微珠上 固定用于捕獲不同目標(biāo)物質(zhì)的物質(zhì)。在載體采取絲的形狀的情況下，可以在絲的各不同位 置處固定用于捕獲不同目標(biāo)物質(zhì)的物質(zhì)。在BIST的情況下，載體采取球（微珠）的形狀。
[0039] 球（微珠）的大小為1mm左右，可以為塑料、陶瓷等材質(zhì)的物體，這樣的球（微珠） 記載于日本特開(kāi)2000-346842號(hào)公報(bào)、日本特表平14-534657號(hào)公報(bào)等。
[0040] 磁性微珠的大小為幾十μ m，可以通過(guò)使鐵粉等與塑料、陶瓷等混合進(jìn)行磁化而 成。這樣的磁性微珠記載于日本特開(kāi)平8-62224號(hào)公報(bào)（專利第3115501號(hào)說(shuō)明書(shū)）、國(guó)際 公開(kāi)W096/29602小冊(cè)子、國(guó)際公開(kāi)W097/44671小冊(cè)子等。
[0041] 絲（線）的大小為直徑0.1 mm左右，可以為樹(shù)脂系的材質(zhì)，這樣的絲記載于日本特 開(kāi)2006-214759號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)W001/53831小冊(cè)子、國(guó)際公開(kāi)W02003/7901小冊(cè)子等。
[0042] 載體適合1維或2維地配置。載體1維地配置是指，用于確定觀測(cè)到的發(fā)光信號(hào)源 自哪個(gè)載體所需要的位置信息是1維的狀態(tài)，例如，BIST中，可以說(shuō)載體（微珠）是1維地 配置的。載體2維地配置是指，用于確定觀測(cè)到的發(fā)光信號(hào)源自哪個(gè)載體所需要的位置信 息是2維的狀態(tài)，例如，在板上以單層鋪滿載體的測(cè)定試劑盒可以說(shuō)載體是2維地配置的。
[0043] 用于捕獲目標(biāo)物質(zhì)的物質(zhì)可以通過(guò)共價(jià)鍵、化學(xué)吸附、物理吸附、電相互作用