赭曲霉毒素a的檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種霉菌毒素殘留的免疫化學(xué)快速檢測技術(shù)，具體設(shè)及髓曲霉毒素A 的檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 髓曲霉毒素一般是由曲霉菌和青霉菌代謝產(chǎn)生，它們是髓曲霉毒素A，B，C，化其 中髓曲霉毒素A(OTA)是髓曲霉毒素中毒性最大的物質(zhì)，屬烈性的肝臟和腎臟毒素，并具有 致癌、致崎和致突變性。0TA廣泛存在于各種食物中，花生、谷物及其副產(chǎn)品是0TA的主要 來源。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將0TA定位為2B類致癌物（即可能引起人類癌癥的物質(zhì)）。由 于0TA的危害性，各國都立法對食物中的0TA殘留進(jìn)行限定，我國規(guī)定食品中髓曲霉毒素 的含量：谷物、豆類及其制品小于5.0 yg/kg;歐盟規(guī)定胡椒中的髓曲霉毒素A殘留限量為 15 y g/kg，辣椒中為30 y g/kg，小麥蛋白中為8. 0 y g/kg。及時進(jìn)行檢測和分析是預(yù)防和控 制0TA危害的有效手段。
[0003] 目前檢測髓曲霉毒素的方法一般有生物鑒定法、儀器分析法、化學(xué)分析法和免疫 分析法等。生物鑒定法主要作為定性判斷真菌毒素的手段，因此該方法對樣品專一性不強(qiáng)、 純度要求不高、敏度差，一般不單獨使用僅作為化學(xué)分析法的佐證。儀器分析方法樣品前處 理過程中親和柱凈化時間長，成本高；最后定量過程需要HPLC，操作過程復(fù)雜、時間長。該 些方法無法滿足現(xiàn)場檢測的需要，同時不易被基層小型實驗室的檢測人員所掌握和應(yīng)用。 免疫學(xué)檢測技術(shù)的出現(xiàn)，為霉菌毒素快速檢測提供了技術(shù)手段，較常應(yīng)用的是化ISA方法 和免疫膠體金層析法，該兩種方法各有優(yōu)缺點。ELISA方法經(jīng)過多次洗脫過程，標(biāo)記物酶易 失活，底物見光易分解，環(huán)境干擾因素復(fù)雜等缺點。膠體金層析法可W滿足現(xiàn)場快速的要 求，但是只能定性檢測無法得到定量結(jié)果。
[0004] 現(xiàn)有一些0TA的快速檢測方法，如專利CN103278630B同步檢測黃曲霉毒素和髓曲 霉毒素A混合污染的免疫層析試紙條、制備方法及其應(yīng)用、專利CN 103808935A-種用于檢 測髓曲霉毒素的化ISA試劑盒的制備、專利CN103575886A檢測髓曲霉毒素A的酶聯(lián)免疫試 劑盒及其應(yīng)用。公開的免疫層析試紙條需要肉眼判斷檢測結(jié)果，只能定性檢測無法定量；公 開的免疫試劑盒則均采用酶聯(lián)免疫分析方法。酶聯(lián)免疫分析方法是采用固相吸附分離的方 法，需要固相材料吸附捕獲抗體-待檢抗原-標(biāo)記抗體，由于標(biāo)記抗體為過量，所W檢測前 均需要洗漆去除未參加反應(yīng)的標(biāo)記抗體。此時，通過檢測與待測抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體，才能 與待測抗原呈正比例關(guān)系。
[0005] 固相吸附分離方法有兩個重要環(huán)節(jié)；包被和洗漆。固相吸附分離方法設(shè)計巧妙，操 作簡單，故應(yīng)用非常廣泛。但是，此種非均相反應(yīng)模式因包被和洗漆環(huán)節(jié)的存在，給標(biāo)記免 疫分析造成很大缺陷，主要表現(xiàn)在W下兩個方面：
[0006] 1.在包被過程，無論物理吸附還是化學(xué)連接，包被于固相材料表面的抗體分子其 構(gòu)象不同于處于液相中的抗體分子，與抗原分子結(jié)合能力因空間位阻效應(yīng)將受到一定限 審IJ;無論采用微球還是微孔板作為固相材料，由于包被面積有限，捕獲抗體分子不能最大限 度滿足大量待測抗原的需要，由此將影響檢測范圍。
[0007] 2."洗板"或"洗球"是非均相免疫分析中的重要環(huán)節(jié)且多次出現(xiàn)。洗漆過程增加 檢測程序的復(fù)雜性，增加檢測時間并給實現(xiàn)自動化帶來障礙。此外，由于洗漆過程特別是酶 免疫分析，難于實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，每個測試孔之間洗漆效果不同，在一定程度上影響檢測的精密 度，出現(xiàn)批間、批內(nèi)差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于提供一種髓曲霉毒素A的檢測試劑盒，W解決現(xiàn)有檢測盒中試 劑種類多，其檢測方法操作繁瑣，檢測靈敏度低的問題。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種髓曲霉毒素A的檢測方法。
[0010] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用W下技術(shù)方案。
[0011] 一種髓曲霉毒素A的檢測試劑盒，其包括如下試劑；受體微球、供體微球、生物素 化髓曲霉毒素A、髓曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品；
[0012] 其中，所述受體微球包被有髓曲霉毒素A抗體，所述供體微球包被有鏈霉親和素。
[0013] 如上所述的髓曲霉毒素A檢測試劑盒，優(yōu)選地，該檢測試劑盒還包括50%甲醇， 10%氯化鋼水溶液，用于處理樣品。
[0014] 如上所述的髓曲霉毒素A檢測試劑盒，優(yōu)選地，所述受體微球的濃度為10 y g/ 血~30 y g/mU所述供體微球的濃度為10 y g/mL~30 y g/mU所述生物素化髓曲霉毒素A 濃度為 3 y g/mL ~10 y g/mL。
[0015] 如上所述的髓曲霉毒素A檢測試劑盒，優(yōu)選地，所述受體微球的緩沖溶液為含有 質(zhì)量百分比為0. 2% BSA，體積百分比為0. 02% Proclin-300的PBS溶液，所述生物素化髓 曲霉毒素A的緩沖液為PBS溶液，所述供體微球的緩沖溶液為終濃度為25mM 4-哲己基嗽 嗦己橫酸（肥陽巧，lOOmM化CI0.0 5% Proclin-300,抑7. 4的溶液。
[0016] 利用如上所述的髓曲霉毒素A檢測試劑盒檢測髓曲霉毒素A的檢測方法，包括W 下步驟：
[0017] 1)將所述髓曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品配置成具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品；
[0018] 2)反應(yīng)板每孔加入所述受體微球，生物素化髓曲霉毒素A抗原；之后，分別在各孔 加入待測樣品、步驟1)制備的標(biāo)準(zhǔn)品；
[0019] 如振蕩，室溫或37°C避光解育5min~lOmin;
[0020] 4)每孔加入所述供體微球，振蕩條件下，室溫或37°C避光解育5min~lOmin ;
[0021] 5)結(jié)果讀??；將反應(yīng)板置于均相免疫檢測儀上讀數(shù)；
[0022] 6)檢測結(jié)果分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測的結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的檢測結(jié)果對應(yīng) 標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可獲得檢測樣品中髓曲霉毒素A的含量。
[0023] 如果待檢樣品為固體時，要對樣品進(jìn)行前處理，提取上清液進(jìn)行檢測。
[0024] 如上所述的檢測方法，優(yōu)選地，采用90 y L反應(yīng)體系，所述受體微球的加入量 為25 所述生物素化髓曲霉毒素A的加入量為15 ^以所述樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的加入量為 35化，所述供體微球的加入量為15 y L。
[0025] 如上所述的檢測方法，優(yōu)選地，所述步驟（3)中37°C避光解育的時間為5min，所述 步驟（4)中37°C避光解育的時間為lOmin。
[0026] 如上所述的檢測方法，優(yōu)選地，所述步驟（6)檢測結(jié)果分析包括：
[0027] a.用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的巧光計數(shù)值除W髓曲霉毒素A濃度為0的 巧光計數(shù)值再乘W 100%，得到百分巧光計數(shù)值；W髓曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對數(shù)值為 X軸，百分巧光計數(shù)值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[002引 b.按步驟a所述的百分巧光計數(shù)值計算方法，計算所述待測樣品的百分巧光計數(shù) 值，相對應(yīng)該待測樣品的百分巧光計數(shù)值，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出所述待測樣品中髓曲霉 毒素A的含量。
[0029] 一種檢測髓曲霉毒素A的檢測方法，包括如下步驟：
[0030] 1)配置具有濃度梯度的髓曲霉毒素A作為標(biāo)準(zhǔn)品；
[0031] 2)反應(yīng)板每孔加入包被有髓曲霉毒素A抗體的受體微球，生物素化髓曲霉毒素A 抗原；之后，分別在各孔加入待測樣品、標(biāo)準(zhǔn)品或磯酸鹽緩沖液；
[003引扣振蕩，室溫或37°C避光解育；
[0033] 4)每孔加入包被鏈霉親和素的供體微球，振蕩條件下室溫或37°C避光解育；
[0034] 5)結(jié)果讀??；將反應(yīng)板置于均相免疫檢測儀上讀數(shù)；
[0035] 6)檢測結(jié)果分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測的結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的檢測結(jié)果對應(yīng) 標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可獲得檢測樣品中髓曲霉毒素A的含量。
[0036] 本發(fā)明提供的髓曲霉毒素A的檢測試劑盒，通過特異性的抗原抗體反應(yīng)將納米微 珠對極大的拉近，級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)將信號放大，有效的提高髓曲霉毒素A檢測的精度。該 檢測試劑盒中的檢測試劑穩(wěn)定，靈敏、準(zhǔn)確，具備適用面廣、檢測范圍寬、靈敏度高、特異性 強(qiáng)、檢測通量大、線性范圍較寬等優(yōu)點。
[0037] 采用本發(fā)明提供的髓曲霉毒素A檢測方法，進(jìn)行髓曲霉毒素A的檢測時，操作簡 單、混合后即可測定，避免了傳統(tǒng)免疫分析中洗脫、分離等繁瑣過程，一方面，有效降低了非 特異性反應(yīng)的可能性W及背景噪音的影響，顯著提高了分析效率和檢測靈敏度；另一方面 大大縮短檢測時間，并可在現(xiàn)場快速檢測糧食谷物中的髓曲霉毒素A殘留，檢測全過程控 制在20min之內(nèi)，檢測限符合中國及歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)。
[003引利用本發(fā)明提供的髓曲霉毒素A的檢測試劑盒，進(jìn)行髓曲霉毒素A檢測的靈敏