定量檢測25-羥基維生素d的免疫層析試劑條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及定量檢測25-羥基維生素D的免疫層析試劑條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素D為類固醇衍生物，屬脂溶性維生素。人體中的維生素D僅有小部分來源于食物，體內(nèi)所需的維生素D的95%來源于陽光中紫外線照射皮膚產(chǎn)生。維生素D經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，在25-羥化酶作用下轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D，然后在腎近端小管上皮細(xì)胞線粒體內(nèi)α羥化酶系統(tǒng)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?，25-二羥基維生素D，它是維生素D最大的生物作用形式，可以促進(jìn)腸道鈣結(jié)合蛋白的合成。而25-羥維生素D是代謝中的主要循環(huán)形式，能反映機(jī)體的維生素D儲存水平并與維生素D缺乏的臨床癥狀相關(guān)聯(lián)，因此25-羥基維生素D是衡量維生素D體內(nèi)水平的最可靠的臨床指標(biāo)。
[0003]維生素D的主要作是調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，靠促進(jìn)鈣和磷在腸道內(nèi)的吸收，以及腎小管重吸收鈣磷的方式，來提高血液中的鈣磷水平，并用鈣化的方法，與甲狀旁腺激素和降鈣素以及其他激素共同作用，使骨質(zhì)變得堅(jiān)硬。除了具有傳統(tǒng)意義上的骨骼效應(yīng)，還具有影響自身免疫疾病、心血管病、糖尿病、腫瘤等非骨骼效應(yīng)。研宄發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏會(huì)直接影響人類基因的表達(dá)，這些基因與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和糖尿病等眾多疾病有關(guān)。維生素D缺乏會(huì)導(dǎo)致少兒佝僂病和成年人的軟骨病。研宄還表明維生素D缺乏可能使某些癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高。
[0004]臨床上對維生素D的定量檢測已成為常規(guī)檢測項(xiàng)目和體檢項(xiàng)目。建立一種快速，簡便，靈敏，準(zhǔn)確可靠的檢測維生素D水平的方法尤為重要。目前25-羥維生素D的測定方法主要有酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、液相色譜-質(zhì)譜檢測法以及化學(xué)發(fā)光法。酶聯(lián)免疫法自動(dòng)化程度不高，且受人為因素影響較大。放射免疫法存在著環(huán)境污染問題；液相色譜質(zhì)譜操作復(fù)雜，用時(shí)較長；而化學(xué)發(fā)光法靈敏度雖高，但檢測成本較高，需要特定化學(xué)發(fā)光儀，這些原因?qū)е缕鋺?yīng)用范圍較小。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供一種定量檢測25-羥基維生素D的免疫層析試劑條及其制備方法，具有采樣容易、操作簡便、敏感度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層醫(yī)院、診所以及體檢中心等單位使用，對于降低維生素D檢測成本、普及人體維生素D檢測、減少臨床盲目用藥具有重要意義。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
一種定量檢測25-羥基維生素D的免疫層析試紙條，包括依次設(shè)置的加樣區(qū)、結(jié)合物釋放區(qū)、反應(yīng)區(qū)和吸水區(qū)；所述結(jié)合物釋放區(qū)為包被膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體的玻璃纖維素膜；所述反應(yīng)區(qū)為測試區(qū)和控制區(qū)，測試區(qū)包被25羥基維生素D-偶聯(lián)蛋白，控制區(qū)包被羊抗鼠IgG抗體的硝酸纖維素膜。
[0007]所述膠體金、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料都是作為免疫層析技術(shù)中的標(biāo)記物，間接讀出待測物的濃度。
[0008]膠體金已發(fā)展成為免疫層析技術(shù)中最常用到的標(biāo)記物。但是其主要進(jìn)行定性或半定量檢測，限制了它的應(yīng)用范圍。
[0009]膠體金的定量免疫層析技術(shù)的原理:膠體金顆粒在特定波長下，對光的吸收和散射與膠體金顆粒的量相關(guān)，通過光電感應(yīng)器檢測膠體金顆粒對光的吸收和散射，從而獲得待測抗原的量。
[0010]量子點(diǎn)是一種半導(dǎo)體納米晶，它激發(fā)光譜寬，呈連續(xù)分布，而發(fā)射光譜窄，單色性好且顏色可調(diào)，發(fā)光強(qiáng)度是傳統(tǒng)有機(jī)熒光素的20~50倍，并且具有持久的光化學(xué)穩(wěn)定性，其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)使其作為一種新型的熒光探針而得到廣泛關(guān)注。量子點(diǎn)作為標(biāo)記物較之膠體金具有更高的靈敏度。
[0011]量子點(diǎn)缺點(diǎn):制備條件茍1刻、反應(yīng)步驟比較復(fù)雜、試劑成本高、毒性較大等。
[0012]上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)是免疫層析原理與光電轉(zhuǎn)換原理相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)，以上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒作為示蹤物，經(jīng)過紅外光激發(fā)后上傳發(fā)光顆粒發(fā)射可見光，實(shí)現(xiàn)能量的上轉(zhuǎn)，通過對光學(xué)信號的轉(zhuǎn)換，能夠快速對待測物進(jìn)行定量檢測。
[0013]上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的優(yōu)點(diǎn):可以有效降低光致電離作用引起基質(zhì)材料的衰退；不需要嚴(yán)格的相位匹配，對激發(fā)波長的穩(wěn)定性要求不高；輸出波長具有一定的可調(diào)協(xié)性。
[0014]上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的缺點(diǎn):反應(yīng)時(shí)間較長；標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍相對較窄；發(fā)光效率較低，穩(wěn)定性較差。
[0015]本發(fā)明所述定量檢測25-羥基維生素D的免疫層析試紙條將包被有膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體的結(jié)合物釋放區(qū)與包被有25-羥基維生素D-偶聯(lián)蛋白的測試區(qū)連在一起，利用膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)免疫層析法競爭性結(jié)合單抗原理，即被檢測者血清的25-羥基維生素與包被在硝酸纖維素膜上的25-羥基維生素D-偶聯(lián)蛋白競爭性結(jié)合25-羥基維生素D單克隆抗體的原理，通過檢測測試區(qū)的顏色深淺(或被激發(fā)的量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度或被激發(fā)的UCP顆粒的發(fā)光強(qiáng)度)，定量檢測人血清中的25-羥基維生素D。
[0016]當(dāng)血清中不存在25-羥基維生素D時(shí)，膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體由于毛細(xì)管作用沿著結(jié)合物釋放區(qū)移動(dòng)至測試區(qū)，與該測試區(qū)包被在硝酸纖維素膜上的25-羥基維生素D結(jié)合，從而在測試區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶(或經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號或經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生強(qiáng)的發(fā)射光)；當(dāng)血清中存在25-羥基維生素D時(shí)，膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體首先與血清中的25-羥基維生素D結(jié)合形成復(fù)合物，然后受毛細(xì)管作用沿著結(jié)合物釋放區(qū)移動(dòng)至測試區(qū)，但沒有或僅有少量的膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體與測試區(qū)的25-羥基維生素D-偶聯(lián)蛋白結(jié)合，測試區(qū)線顏色消失或變淺(或經(jīng)激發(fā)后只能產(chǎn)生弱的熒光信號或經(jīng)激發(fā)后只能產(chǎn)生弱的發(fā)射光)，在一定條件下，測試區(qū)線顏色的深淺(或熒光的強(qiáng)度或發(fā)射光的強(qiáng)度)和樣品中的濃度呈負(fù)相關(guān)，采用相應(yīng)的免疫層析儀可定量判斷人血清中的25-羥基維生素D濃度。
[0017]而控制區(qū)包被羊抗鼠IgG抗體，膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體與包被的羊抗鼠IgG抗體結(jié)合，從而在控制區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶(或經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號或經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生強(qiáng)的發(fā)射光)，可判斷試紙條及檢測結(jié)果是否有效，也作為測定試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。如果控制區(qū)沒有產(chǎn)生紫紅色條帶(或經(jīng)激發(fā)后沒有產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號或經(jīng)激發(fā)后沒有產(chǎn)生強(qiáng)的發(fā)射光)，則說明試紙條失效。
[0018]進(jìn)一步的，本發(fā)明所述25-羥基維生素D檢測試紙條還包括PVC背襯板，所述加樣區(qū)、結(jié)合物釋放區(qū)、反應(yīng)區(qū)、吸水區(qū)依次相互搭接的粘貼在PVC背襯板上。
[0019]由于25-羥基維生素D的濃度最終由膠體金的顏色深淺(或量子點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射光強(qiáng)度)來決定，因此25-羥基維生素D單克隆抗體扮演了連接膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)和25-羥基維生素D這兩種物質(zhì)的重要角色，既能與膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)結(jié)合，又能與25-羥基維生素D結(jié)合，其中25-羥基維生素D單克隆抗體與25-羥基維生素D結(jié)合是一個(gè)自發(fā)的過程，而25-羥基維生素D單克隆抗體與膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的結(jié)合需要人為的促進(jìn)。生產(chǎn)的一個(gè)重要步驟就是膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)
25-羥基維生素D單克隆抗體。
[0020]其中，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的25-羥基維生素D單克隆抗體的制備方法為向ImL pH7.4，50mM的磷酸鹽緩沖液中加入2 μ mol膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)和Img鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體，室溫下溫和振蕩2小時(shí)，然后12000r/min離心30min，取沉淀即得。
[0021]所述25羥基維生素D-偶聯(lián)蛋白的制備方法包括以下步驟:
將1mg維生素D溶解于100 μ L有機(jī)溶劑中，然后在攪拌條件下向10mL，濃度為5mg/mL的偶聯(lián)蛋白溶液中逐滴加入溶解后的維生素D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為I %?3%，攪拌5min?20min后移至4°C下攪拌反應(yīng)16h?18h，反應(yīng)后的反應(yīng)液用PBS緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用0.45 μm濾膜過濾，得到維生素D與偶聯(lián)蛋白的偶聯(lián)物，即25羥基維生素D-偶聯(lián)蛋白，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022]其中，所述有機(jī)溶劑為三氯甲烷、甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、二甲基亞砜、1，4_ 二氧六環(huán)中的一種。
[0023]其中，所述偶聯(lián)蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白(OVA)或血藍(lán)蛋白(KLH)中的一種。
[0024]其中，所述鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體、25-羥基維生素D和羊抗鼠IgG抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以通過商業(yè)途徑獲得或通過現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法制備得到。
[0025]作為信號讀取的膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)是試紙條定量檢測中的重點(diǎn)。膠體金(或量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP)的大小、均一度、穩(wěn)定性都會(huì)影響產(chǎn)品的最后讀數(shù)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述25-羥基維生素D檢測試紙