熒光融合多肽、包含所述多肽的生物感應器及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其是熒光融合多肽、包含所述多肽的生物感應器及 其用途。
【背景技術】
[0002] 以下背景探討僅用于促進讀者對本發(fā)明的理解，并不應理解為描述或構成本發(fā)明 的現(xiàn)有技術。
[0003] 基于細胞體系的高容量篩選（HCS)使用活細胞作為生物研宄工具，用于說明正常 細胞和患病細胞的活動。HCS還用于發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化新備選藥物。
[0004] 高容量篩選是現(xiàn)代細胞生物學及其分子工具與自動化高解析度顯微鏡和機器人 操作的結合。首先，令細胞接觸化學試劑或RNAi試劑。然后，使用圖像分析來檢測細胞形 態(tài)改變。使用各種技術，例如與內(nèi)源蛋白融合的綠色熒光蛋白或熒光抗體，來測定細胞合成 蛋白量的改變。
[0005] 在細胞尺度上并行采集不同細胞性質的數(shù)據(jù)，例如信號級聯(lián)傳導活動和細胞谷歌 完整性，是該方法的主要優(yōu)勢，與之相比，高通量篩選較快，但不夠詳細。雖然HCS相比較 慢，但所得的豐富數(shù)據(jù)允許對藥物作用的理解更深刻。在此意義上，HCS獲取信號級聯(lián)轉導 活動相關數(shù)據(jù)的目的之一，在于通討測量朐內(nèi)第二信伸水平，來測宙不同藥物在信號傳導 過程中的作用。
[0006] 第二信使是從細胞表面的受體處接力將信號傳遞給細胞內(nèi)細胞質或細胞核中的 目標分子。他們接力傳導荷爾蒙信號（例如腎上腺素、生長因子等）并引起細胞活動的某 些改變。他們極大地放大信號強度。第二信使是信號級聯(lián)轉導的參與者之一。這些第二信 使中，cAMP和鈣是第二信使概念的范例，且被認為是普遍存在并調(diào)控許多細胞內(nèi)關鍵過程 的關鍵胞內(nèi)分子。
[0007] 理想狀態(tài)下，所述測量要求精確定位、高動態(tài)范圍的、以及盡可能少的細胞生理學 干擾的工具，其能夠使用高容量篩選方法來監(jiān)控體內(nèi)第二信使水平。
[0008] 基于此，產(chǎn)生了各種基于熒光性質動態(tài)變化的熒光生物感應器。在此意義上，所述 生物感應器種類通?；跓晒夤舱衲芰哭D移（FRET)的改變。FRET是能量通過非輻射的偶 極到偶極的偶聯(lián)，從激發(fā)的供體熒光團轉移到受體熒光團的過程。該能量傳遞的效率高度 依賴于供體和受體熒光團之間的距離（例如，對CFP/YFP而言<10nm)和相對方向。但是，高 容量篩選方法中，基于FRET的生物感應器要求至少具有4個過濾器的探測設備，其中2個 用于激發(fā)，2個用于發(fā)射。此外，由于探測信號的強度低，探測信號范圍和篩選敏感性也低。 最后，使用大于1個熒光發(fā)射信號，要求使用更多算法以正確地分析最終信號。
[0009] 因此，仍存在開發(fā)用于在活細胞動態(tài)環(huán)境中實時測量第二信號濃度的改進方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的第一個方面，涉及一種熒光融合多肽，能夠在細胞質中的第二信使?jié)舛?增加時，將自己在細胞中的定位從細胞質膜轉移至滯留囊泡中，所述多肽包含膜定位肽、第 二信使轉導蛋白結合肽、內(nèi)質網(wǎng)滯留信號和熒光肽，其中：
[0011] a.所述膜定位肽位于所述熒光融合多肽的N端，且物理性地連接在所述熒光多肽 上，可選地，所述連接是通過連接子；而所述熒光多肽物理性地連接在所述第二信使轉導蛋 白結合肽上，可選地，所述連接是通過連接子；以及
[0012] b.所述第二信使轉導蛋白結合肽物理性地連接在所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號上，可選 地，所述連接是通過連接子，而所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號位于所述熒光融合多肽的C端。
[0013] 在本發(fā)明第一方面的另一個優(yōu)選實施例中，所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的 白細胞介素-2受體的胞外域，或根據(jù)氨基酸同源性與所述序列整個區(qū)域具有至少90%同 源性的變體；以及，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號是選自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其 中X為任意氨基酸，且優(yōu)選地，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號是KDEL。
[0014] 本發(fā)明第一方面的更優(yōu)選實施例中，所述第二信使轉導蛋白結合肽是cAMP轉導 蛋白結合多肽、鈣轉導蛋白結合多肽、IP3轉導蛋白結合多肽、cGMP轉導蛋白結合多肽或甘 油二脂轉導蛋白結合多肽。因此，在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明第一方面的熒 光融合多肽能夠在細胞質中的第二信使?jié)舛仍黾訒r將自己在細胞中的定位從細胞質膜轉 移至滯留囊泡中，且所述第二信使選自：鈣、IP3、cAMP或甘油二酯。
[0015] 本發(fā)明的第二方面中，涉及一種熒光融合多肽，所述多肽能夠在胞內(nèi)鈣濃度增加 時，將自己在細胞中的定位從細胞質膜轉移至滯留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含鈣 調(diào)素結合序列的第二信使轉導蛋白結合肽、內(nèi)質網(wǎng)滯留信號和熒光肽，其中：
[0016] a.所述膜定位肽位于所述熒光融合多肽的N端，且物理性地連接在所述熒光多肽 上，可選地，所述連接是通過連接子；而所述熒光多肽物理性地連接在包含鈣調(diào)素結合序列 的所述第二信使轉導蛋白結合肽上，可選地，所述連接是通過連接子；以及
[0017] b.所述第二信使轉導蛋白結合肽物理性地連接在所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號上，可選 地，所述連接是通過連接子，而所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號位于所述熒光融合多肽的C端。
[0018] 在本發(fā)明第二方面的一個優(yōu)選實施例中，所述鈣調(diào)素結合序列選自SEQ ID No 1 (MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL) , SEQ ID No 2 (ASPWKSARLMVHTVATFNSI), SEQ ID No 3 (AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ), SEQ ID No 4(KKTFKEVANAVKISASLMGT), SEQ ID No 5(GAVLKVLTTGLPALISWIKR), SEQ ID No 6 (RGGFRRIARLVGVLREWAYR), SEQ ID No 7(GGRLALLRARLKELAALEAA)和 SEQ ID No 8(AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP)或根據(jù)氨基酸同源性 與任一所述序列的整個區(qū)域具有至少90%同源性的變體。
[0019] 在本發(fā)明第二方面的又一個優(yōu)選實施例中，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號是選自KDEL、 HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X為任意氨基酸，且其中優(yōu)選地，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信 號為KDEL和/或所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白細胞介素-2受體的胞外域，或根 據(jù)氨基酸同源性與任一所述序列的整個區(qū)域具有至少90%同源性的變體。
[0020] 在本發(fā)明第二方面的另一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的所述熒光多肽選自GFP、YFP、 turboGFP、tRFP 和 tRFP602〇
[0021] 在本發(fā)明第二方面的又一個優(yōu)選實施例中，
[0022] a?所述鈣調(diào)素結合序列選自 SEQ ID No l(MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、 SEQ ID No 2(ASPWKSARLMVHTVATFNSI), SEQ ID No 3(AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ), SEQ ID No 4(KKTFKEVANAVKISASLMGT), SEQ ID No 5 (GAVLKVLTTGLPALISWIKR) , SEQ ID No 6 (RGGFRRIARLVGVLREWAYR)、SEQ ID No 7 (GGRLALLRARLKELAALEAA)和 SEQ ID No 8 (AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP)或根據(jù)氨基酸同源性與任一所述序列的整個區(qū)域具有至少 90 %同源性的變體；
[0023] b.所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白細胞介素-2受體的胞外域或根據(jù)氨基 酸同源性與所述序列整個區(qū)域具有至少90%同源性的變體；以及
[0024] c.所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號是選自1(0￡1、1^1、1(1?乂、1?1?乂和1?1?的多肽，其中父為 任意氨基酸，且優(yōu)選地，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號為KDEL。
[0025] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，所述鈣熒光融合多肽包括SEQ ID No 15,或優(yōu) 選地，由SEQ ID No 15組成。
[0026] 本發(fā)明第三個方面涉及一種熒光融合多肽，所述多肽能夠在胞內(nèi)cAMP濃度增加 時，將自己在細胞中的定位從細胞質膜轉移至滯留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含與 PKA的RI和RII調(diào)控域結合的結合序列的第二信使轉導蛋白結合肽、內(nèi)質網(wǎng)滯留信號和熒 光肽，其中：
[0027] a.所述膜定位肽位于所述熒光融合多肽的N端，且物理性地連接在所述熒光多肽 上，可選地，所述連接是通過連接子；而所述熒光多肽物理性地連接在所述第二信使轉導蛋 白結合肽上，可選地，所述連接是通過連接子；以及
[0028] b.所述第二信使轉導蛋白結合肽物理性地連接在所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號上，可選 地，所述連接是通過連接子，而所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號位于所述熒光融合多肽的C端。
[0029] 在本發(fā)明第三方面的一個優(yōu)選實施例中，與PKA的RI和RII調(diào)控域 結合的結合序列選自：SEQ ID No 9(DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY)、SEQ ID no 10 (VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ),SEQ ID No 11(VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ),SEQ ID No 12(FEELAWKIAKMIWSDVFQQ)、SEQ ID No 13(QIEYLAKQIVDNAIQQAK)和 SEQ ID No 14(LEQYANQLADQIIKEATE)或根據(jù)氨基酸同源性與所述序列整個區(qū)域具有至少90%同源性 的變體。
[0030] 在本發(fā)明第三方面的又一個優(yōu)選實施例中，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號是選自KDEL、 HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X為任意氨基酸，且其中優(yōu)選地，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信 號為KDEL，和/或所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白細胞介素-2受體的胞外域或根據(jù) 氨基酸同源性與所述序列整個區(qū)域具有至少90%同源性的變體。
[0031] 在本發(fā)明第三方面的又一個優(yōu)選實施例中，所述熒光多肽選自GFP、YFP、 turboGFP、tRFP和tRFP602。在本發(fā)明第三方面的又一個優(yōu)選實施例中，
[0032] a.所述與PKA的RI和RII調(diào)控域結合的結合序列選自SEQ ID No 9 (DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY)、SEQ ID no 10 (VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID No 11 (VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ),SEQ ID No 12 (FEELAWKIAKMIWSDVFQQ),SEQ ID No 13(QIEYLAKQIVDNAIQQAK)和 SEQ ID No 14(LEQYANQLADQIIKEATE)，或根據(jù)氨基酸同源性與 任一所述序列的整個區(qū)域具有至少90%同源性的變體；
[0033] b.所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白細胞介素-2受體的胞外域或根據(jù)氨基 酸同源性與所述序列整個區(qū)域具有至少90%同源性的變體；以及
[0034] c.所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號是選自1(0￡1、冊￡1、1(1?乂、1?1?乂和1?1?的多肽，其中父為 任意氨基酸，且其中優(yōu)選地，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號為KDEL。
[0035] 在本發(fā)明第三方面的又一個優(yōu)選實施例中，所述熒光融合多肽包含SEQ ID No 16,或優(yōu)選地，由SEQ ID No 16組成。
[0036] 本發(fā)明第四個方面涉及一種熒光融合多肽，所述多肽能夠在胞內(nèi)甘油二脂濃度增 加時，將自己在細胞中的定位從細胞質膜轉移至滯留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含 與PKCS，結合的結合序列的第二信使轉導蛋白結合肽、內(nèi)質網(wǎng)滯留信號和熒光肽，其中：
[0037] a.所述膜定位肽位于所述熒光融合多肽的N端，且物理性地連接在所述熒光多肽 上，可選地，所述連接是通過連接子；而所述熒光多肽物理性地連接在所述第二信使轉導蛋 白結合肽上，可選地，所述連接是通過連接子；以及
[0038] b.所述第二信使轉導蛋白結合肽物理性地連接在所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號上，可選 地，所述連接是通過連接子，而所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號位于所述熒光融合多肽的C端。
[0039]在本發(fā)明第四方面的一個優(yōu)選實施例中，所述與PKC S，結合的結合序列為SEQ ID No 19(AARKRKGSFFYGG)或根據(jù)氨基酸同源性與所述序列整個區(qū)域具有至少90%同源性的 變體。
[0040] 在本發(fā)明第四方面的又一個優(yōu)選實施例中，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信號是選自KDEL、 HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X為任意氨基酸，且其中優(yōu)選地，所述內(nèi)質網(wǎng)滯留信 號為KDEL，和/或所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白細胞介素-2受體的胞外域或根據(jù) 氨基酸同源性與所述序列整個區(qū)域具有至少90%同源性的變體。
[0041] 在本發(fā)明第四方面的又一個優(yōu)選實施例中，所述熒光多肽選自GFP、YF