細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞研宄領(lǐng)域，尤其是涉及一種細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)的在觀察研宄因子誘導(dǎo)下細(xì)胞運動方向發(fā)生改變主要依靠專門的設(shè)備，如 μ -SIideChemotaxis2D/3D。該設(shè)備的基本原理是搭配微量分注器用于兩側(cè)儲液槽中制造 出化學(xué)物質(zhì)的線性濃度梯度，此時培養(yǎng)于儲液槽中間的觀察管道中的細(xì)胞即處于穩(wěn)定的線 性濃度梯度培養(yǎng)環(huán)境中，適于分析2D/3D基質(zhì)表面緩慢迀移的細(xì)胞的趨化性反應(yīng)，例如癌 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞等；其他緩慢迀移的細(xì)胞趨化性試驗以及利用顯微視頻進行 細(xì)胞示蹤的試驗等。
[0003] 雖然y-SlideChemotaxis2D/3D等設(shè)備能夠證明趨化因子濃度梯度可以改變研 宄對象運動方向，但依然存在以下幾個問題：第一，此設(shè)備并不能很好的限定待研宄因子的 具體方向；第二，不能夠確切的觀察細(xì)胞內(nèi)部各研宄指標(biāo)極性方向的改變；第三，顯微鏡視 頻進行示蹤是必不可少的，而這對顯微鏡是一種過分的耗損；第四，設(shè)備價格昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要提供一種能夠方便、直觀的觀察化學(xué)因子作用下細(xì)胞內(nèi)待研宄的 目標(biāo)物質(zhì)的極性方向變化的細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法。
[0005] 一種細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0006] 步驟一：使用激光共聚焦培養(yǎng)皿作為細(xì)胞極性模型的研宄裝置，圍繞所述激光共 聚焦培養(yǎng)皿中間的培養(yǎng)槽將所述激光共聚焦培養(yǎng)皿分成至少兩個極性控制區(qū)；
[0007] 步驟二：圍繞所述培養(yǎng)槽在所述極性控制區(qū)加入培養(yǎng)基，至少有兩個極性控制區(qū) 內(nèi)的培養(yǎng)基存在待研宄的化學(xué)因子濃度差，其中，所述培養(yǎng)基為固體或半固體培養(yǎng)基；
[0008] 步驟三：向所述培養(yǎng)槽內(nèi)加入細(xì)胞懸浮液，進行細(xì)胞培養(yǎng)，加入的細(xì)胞懸浮液的高 度大于所述培養(yǎng)槽的深度且小于所述培養(yǎng)槽的深度與所述培養(yǎng)基的厚度之和；
[0009] 步驟四：細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，針對細(xì)胞中待研宄的目標(biāo)物質(zhì)對培養(yǎng)槽內(nèi)的細(xì)胞使用 免疫熒光法染色，并采用激光共聚焦顯微鏡進行拍照觀察，以研宄所述目標(biāo)物質(zhì)對所述化 學(xué)因子的極性。
[0010] 在其中一個實施例中，所述步驟一中，在對所述激光共聚焦培養(yǎng)皿劃分極性控制 區(qū)時，是圍繞所述培養(yǎng)槽將所述激光共聚焦培養(yǎng)皿平均分成至少兩個極性控制區(qū)。
[0011] 在其中一個實施例中，所述步驟二中，在圍繞所述培養(yǎng)槽在所述極性控制區(qū)加入 培養(yǎng)基時，首先在相應(yīng)的極性控制區(qū)加入不含有所述化學(xué)因子的空白培養(yǎng)基，待空白培養(yǎng) 基固化或半固化后，再在其他極性控制區(qū)依次加入含有所述化學(xué)因子的培養(yǎng)基，進行固化 或半固化處理，并使至少有兩個極性控制區(qū)內(nèi)的培養(yǎng)基中所述化學(xué)因子存在濃度差。
[0012] 在其中一個實施例中，所述步驟四中，所述針對細(xì)胞中待研宄的目標(biāo)物質(zhì)對培養(yǎng) 槽內(nèi)的細(xì)胞使用免疫熒光法染色包括：
[0013] 對所述細(xì)胞依次進行固定處理、透膜處理及封閉處理；
[0014] 加入與所述目標(biāo)物質(zhì)對應(yīng)的抗體溶液進行孵育處理；
[0015] 加入與所述抗體對應(yīng)的熒光染料標(biāo)記的二抗進行標(biāo)記處理；
[0016] 對標(biāo)記處理后的樣品使用染色液染色處理。
[0017] 在其中一個實施例中，所述步驟四中，所述采用激光共聚焦顯微鏡進行拍照觀察 包括在所述培養(yǎng)槽中選取圓形的觀察范圍的步驟，選取的所述觀察范圍需排除因細(xì)胞與所 述化學(xué)因子的距離而引起的實驗誤差。
[0018] 在其中一個實施例中，所述極性控制區(qū)有四個，其中三個所述極性控制區(qū)加入空 白培養(yǎng)基，其中一所述極性控制區(qū)加入含有所述化學(xué)因子的培養(yǎng)基，所述圓形的觀察范圍 的邊界與含有所述化學(xué)因子的培養(yǎng)基的內(nèi)側(cè)邊緣相切，且與該培養(yǎng)基兩側(cè)的極性控制區(qū)在 所述培養(yǎng)槽內(nèi)的延伸邊界相切。
[0019] 在其中一個實施例中，所述步驟四中，所述研宄細(xì)胞中的目標(biāo)物質(zhì)對所述化學(xué)因 子的極性包括統(tǒng)計所述目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生極化的細(xì)胞數(shù)目占所述觀察視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)目的 百分比。
[0020] 在其中一個實施例中，在統(tǒng)計所述百分比時，是以相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞核中心點為圓 心，細(xì)胞最長軸作為直徑畫圓，得到的圓形區(qū)域即代表該細(xì)胞，然后根據(jù)圓形區(qū)域代表的細(xì) 胞中所述目標(biāo)物質(zhì)的朝向性判斷是否為所述目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生極化的細(xì)胞。
[0021] 在其中一個實施例中，所述根據(jù)圓形區(qū)域代表的細(xì)胞中所述目標(biāo)物質(zhì)的朝向性判 斷是否為所述目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生極化的細(xì)胞是：若朝向含有所述化學(xué)因子的極性控制區(qū)的所述 目標(biāo)物質(zhì)的表達(dá)量大于其它方向上的表達(dá)量，并且在該圓形區(qū)域內(nèi)，所述目標(biāo)物質(zhì)的表達(dá) 量至少有二分之一位于朝向含有該化學(xué)因子的極性控制區(qū)的圓心角為120°的扇形區(qū)域 中，則判斷為目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生極化的細(xì)胞。
[0022] 在其中一個實施例中，所述構(gòu)建方法還包括設(shè)置對照組的步驟，所述對照組的各 個極性控制區(qū)的培養(yǎng)基中不含有所述化學(xué)因子，或者所述對照組的多個極性控制區(qū)中至少 存在一個與實驗組同樣位置的極性控制區(qū)中的培養(yǎng)基具有不同濃度的所述化學(xué)因子。
[0023] 上述細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法具有以下優(yōu)點：
[0024] 1.使用激光共聚焦培養(yǎng)皿作為細(xì)胞趨化性的研宄裝置，通過將培養(yǎng)槽周圍的區(qū)域 分成多個極性控制區(qū)，并在極性控制區(qū)加入培養(yǎng)基，使至少有兩個極性控制區(qū)內(nèi)的培養(yǎng)基 存在待研宄的化學(xué)因子濃度差，從而在細(xì)胞培養(yǎng)后，可以準(zhǔn)確的給出該化學(xué)因子的方向，從 而能夠更清楚的了解該化學(xué)因子對目標(biāo)物質(zhì)極性方向的影響。
[0025] 2.方便操作，實驗者可根據(jù)實驗要求制成2D或者3D形式進行實時觀察。
[0026] 3.在趨化性研宄過程中，顯微鏡示蹤并非必須的，因此可以節(jié)約資源。
[0027] 4.采用激光共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)槽的底部為蓋玻片，可用于要求放大倍數(shù)高、培養(yǎng) 皿底面透光性能好的顯微實驗，如激光共聚焦顯微實驗、熒光顯微實驗和相差顯微實驗等， 同時蓋玻片上述設(shè)有的小孔也能減少實驗過程中抗體等試劑的使用量，節(jié)約資源，降低實 驗成本。
【附圖說明】
[0028] 圖1為一實施方式作用的激光共聚焦培養(yǎng)皿的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029] 圖2為在一實施方式中對皿體劃分極性控制區(qū)的示意圖；
[0030] 圖3為處理Oh后采用激光共聚焦顯微鏡拍攝的照片；
[0031] 圖4為處理6h后采用激光共聚焦顯微鏡拍攝的照片；
[0032] 圖5為處理12h后采用激光共聚焦顯微鏡拍攝的照片；
[0033] 圖6為處理18h后采用激光共聚焦顯微鏡拍攝的照片；
[0034] 圖7為處理24h后采用激光共聚焦顯微鏡拍攝的照片；
[0035] 圖8為細(xì)胞的空間范圍設(shè)定示意圖；
[0036] 圖9為目標(biāo)細(xì)胞占整個視野細(xì)胞的百分比與基質(zhì)膠濃度的關(guān)系示意圖；
[0037] 圖10為目標(biāo)細(xì)胞占整個視野細(xì)胞的百分比與VEGF刺激時間的關(guān)系示意圖。
【具體實施方式】
[0038] 以下主要結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明的細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法作進一步 詳細(xì)的說明。
[0039] -實施方式的細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法，使用激光共聚焦培養(yǎng)皿作為細(xì)胞極性模 型的研宄裝置。如圖1所示，本實施方式所用的激光共聚焦培養(yǎng)皿100包括皿體110和與 皿體110相配合的皿蓋120。皿體110中設(shè)有培養(yǎng)槽102,培養(yǎng)槽102的槽底為蓋玻片130。 培養(yǎng)槽102中用于培養(yǎng)細(xì)胞。蓋玻片130優(yōu)選厚度為0. 19~0. 22mm的進口蓋玻片，可用于 要求放大倍數(shù)高、透光性能好的顯微實驗。在本實施方式的細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法中，首 先將皿體110內(nèi)圍繞培養(yǎng)槽102的部分分成至少兩個極性控制區(qū)，用于加入細(xì)胞極性研宄 的培養(yǎng)基。如圖2所示，在一實施方式中如可以將皿體110分成4個極性控制區(qū)112、114、 116和118?？衫斫猓谄渌麑嵤┓绞街?，極性控制區(qū)的數(shù)量也可以為2個、3個、5個或更多。
[0040] 在本實施方式中，在對皿體110劃分極性控制區(qū)時，是圍繞培養(yǎng)槽102將皿體110 平均分成至少兩個極性控制區(qū)，以排除因極性控制區(qū)大小不一導(dǎo)致的細(xì)胞極化發(fā)生誤差的 現(xiàn)象。
[0041] 在對皿體110劃分極性控制區(qū)之后，該細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法還包括如下步 驟：
[0042] 步驟一：圍繞培養(yǎng)槽在極性控制區(qū)加入培養(yǎng)基，并使至少有兩個極性控制區(qū)內(nèi)的 培養(yǎng)基存