流感病毒的血凝素的測定方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及作為流感病毒的抗原的血凝素的測定方法。
【背景技術】
[0002] 流感病毒屬于正粘病毒科，根據(jù)存在于病毒內(nèi)部的核蛋白和基質蛋白的抗原性不 同被分類為A型、B型和C型。每年可見流行的流感病毒是A型和B型，特別是A型病毒， 根據(jù)作為顆粒表面抗原的糖蛋白的不同，其血凝素被分類為16種亞型、而神經(jīng)氨酸苷酶被 分類為9種亞型，是容易發(fā)生抗原性變異的病毒。因此，必須預測每個季節(jié)的流感流行以選 擇疫苗株，還必須隨著株的變更來準備作為疫苗的主要抗原的血凝素測定用試劑。
[0003] 現(xiàn)有技術文獻 非專利文獻 非專利文獻I:MahmoodN,HayAJ. ,AnELISAutilizingimmobilisedsnowdrop lectinGNAforthedetectionofenvelopeglycoproteinsofHIVandSIV.JImmunol Methods.，151(1992)9-13; 非專利文獻 2:LegasteloisI.等人，Avianglycan-specificIgMmonoclonal antibodiesforthedetectionandquantitationoftypeAandBhaemagglutinins inegg-derivedinfluenzavaccines.JVirolMethods. , 178(2011) 129-136。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明所要解決的課題 作為血凝素的靈敏度高且樣本處理能力高的測定方法，可以列舉使用單克隆抗體和多 克隆抗體的夾層ELISA法，但需要株特異性的兩種抗體，鑒于抗體的制作期間，難以在新型 疫苗制造株或大流行性病毒的血凝素測定中供給單克隆抗體。而且，在如非專利文獻2記 載的使用鳥類的糖鏈特異性單克隆抗體的測定方法中，由于特殊抗體的緣故，與其說是供 給量等問題，不如說是普及性低的測定方法，而且在動物細胞中擴增的流感病毒的血凝素 測定中無法使用。
[0005] 因此，本發(fā)明的目的在于提供流感病毒的血凝素的新型測定方法，與使用兩種抗 血凝素抗體的夾層免疫測定法相比，該方法可以在短期間內(nèi)構建測定系統(tǒng)。
[0006] 用于解決課題的手段 本申請發(fā)明人深入研宄的結果，發(fā)現(xiàn)凝集素與流感病毒的血凝素結合而不與抗體結 合，想到了若用凝集素和抗血凝素抗體夾持血凝素，則需要的抗血凝素抗體只有一種，與使 用兩種抗血凝素抗體的夾層免疫測定法相比可以在短期間內(nèi)構建測定系統(tǒng)，完成了本發(fā) 明。
[0007] S卩，本發(fā)明提供通過夾層免疫測定法進行的流感病毒的血凝素的測定方法，該方 法包括：用與流感病毒的血凝素結合而不與抗體結合的凝集素和與該血凝素進行抗原抗體 反應的抗血凝素抗體夾持該血凝素。
[0008] 發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，使用一種抗血凝素抗體，通過夾層免疫測定，可以高精度地測定流感病毒 的血凝素。
【附圖說明】
[0009] 圖1-1是在利用以下的各表面活性劑處理滅活全顆粒病毒后，通過蛋白質印跡顯 示基于蔗糖密度梯度離心分離法的餾分分析的圖。A.未處理、B. 1.0%的TritonX-IOO處 理、C. 1.0% 的NP-40 處理、D. 1.0% 的Tween80 處理、E. 1.0% 的Brij35 處理、F. 1.0% 的 CHAPS處理、G. 1. 0% 的Zwittergent3-14 處理、H. 1. 0% 的CTAB處理、I. 0. 3% 的SDS處 理、J. 4.OM的尿素處理、K. 3.OM的鹽酸胍處理； 圖1-2同上； 圖2是顯示下述實施例中進行的通過夾層免疫測定測得的血凝素濃度與吸光度的關 系的圖。
【具體實施方式】
[0010] 如上所述，本發(fā)明的方法涉及通過夾層免疫測定法進行的血凝素的測定方法，該 方法是用與流感病毒的血凝素（以下，有時僅稱作"血凝素"）結合而不與抗體結合的凝集 素和與該血凝素進行抗原抗體反應的抗血凝素抗體夾持該血凝素。
[0011] 本發(fā)明的方法中使用的凝集素是與血凝素結合的凝集素。是否與血凝素結合，可 以通過下述參考例2中具體記載的凝集素印記法（使標記凝集素與轉移到PVDF膜上的血 凝素反應，看是否檢測到標記）來確認。另外，"不與抗體結合"是指不與與免疫測定中使 用的構成抗體的免疫球蛋白同種、同類的免疫球蛋白（通常是小鼠、兔或綿羊等的IgG)結 合，不與來自小鼠、兔和綿羊等各動物的IgG結合，如下述參考例3中具體記載的那樣，可以 根據(jù)通過與各動物的HRP標記IgG的ELISA測定的吸光度是否不足陰性對照（空白）平均 值的2倍、優(yōu)選不足1. 5倍來確認。作為與血凝素結合、而不與抗體結合的凝集素的優(yōu)選例 子，可以列舉：曼陀羅凝集素（DSL)、刺桐凝集素（ECL)和蓖麻凝集素（RCA120)。與血凝素 結合、而不與抗體結合的凝集素既可以單獨使用，也可以組合使用兩種以上的凝集素。
[0012] 在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選將上述凝集素固定在固相上再進行夾層法。作為固相， 可以使用夾層ELISA等周知的夾層免疫測定中使用的任一種固相，可以列舉：板、管、珠粒、 膜、凝膠等。作為材質，可以列舉：聚苯乙烯、聚丙烯、尼龍、膠乳、玻璃、交聯(lián)糊精、瓊脂糖、交 聯(lián)瓊脂糖、聚丙烯酰胺等。
[0013] 作為使凝集素吸附在這些固相上的方法，可以采用共價鍵合法、物理吸附法、離子 結合法和生物化學特異性結合法（例如使結合有生物素的凝集素與結合有鏈霉親和素的 固相結合等）等。在操作簡便方面，特別優(yōu)選物理吸附法和生物化學特異性結合法。
[0014] 這里，物理吸附法例如可以列舉下述方法：將凝集素溶解于含有0. 05% Tween20 (商品名）的pH7~9的緩沖液（例如Tris鹽酸緩沖液生理鹽水、磷酸緩沖液生理 鹽水、碳酸緩沖液等）中，之后加入到固相（例如微量培養(yǎng)板的孔）中，在室溫下靜置1~ 2小時左右或者在4°C左右靜置一夜使其吸附。另外，生物化學特異性結合法可以列舉下述 方法：由于結合有鏈霉親和素的固相（板或珠粒）有市售，所以例如將凝集素溶解于含有 0. 05%Tween20 (商品名）的pH7~9的緩沖液（例如Tris鹽酸緩沖液生理鹽水、磷酸緩沖 液生理鹽水、碳酸緩沖液等）中，之后添加到市售的結合有鏈霉親和素的固相中，在室溫下 靜置1~2小時左右或者在4°C左右靜置一夜使其吸附（參照下述實施例）。在物理吸附 法、生物化學特異性結合法中，對與固相反應的凝集素的濃度均沒有特別限定，通常以終濃 度計為10Wg/mL~60jUg/mL左右。
[0015] 在吸附了凝集素的固相表面，有時會殘留沒有吸附凝集素的表面部分，若其中吸 附了樣本中的血凝素或其他分子種類，則有可能無法獲得正確的測定結果。因此，優(yōu)選在樣 本與固相接觸之前添加封閉物質，以包被沒有吸附凝集素的部分。作為這樣的封閉物質，可 以列舉：可以由哺乳動物、例如牛等采集的血清白蛋白、酪蛋白、乳蛋白、乳酸發(fā)酵物、膠原 以及它們的分解物質等，另外，還可以使用作為免疫測定中的封閉物質來銷售的物質。
[0016] 本發(fā)明的方法中使用的抗血凝素抗體是與流感病毒的血凝素進行抗原抗體反應 的物質，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。在進行流感病毒的型特異性測定時，通 常使用與各型血凝素進行特異性抗原抗體反應的抗血凝素單克隆抗體。
[0017] 抗血凝素抗體通常被標記。作為用于標記的標記物質，可以列舉：酶（過氧化物 酶、堿性磷酸酶、-半乳糖苷酶、螢光素酶、乙酰膽堿酯酶等）、同位素（ 125i、131i、3h等）、熒 光色素（氨基苯二酰肼（發(fā)光氨）、異硫氰酸熒光素、7-羥基香豆素（umbellifer〇ne)、7-氨 基-4-甲基香豆素-3-乙酸等）、化學發(fā)光物質、半抗原、生物素、親和素（例如鏈霉親和素 等），但只要是通常能夠用于蛋白標記的物質，則沒有特別限定。需要說明的是，這里的標記 物質還包括：象生物素這樣不直接檢測其本身，而是在組合使用與該物質具有特異性結合 能力的物質（例如親和素）上結合有可檢測的標記的物質的方法中使用的物質。
[0018] 上述的抗體標記方法可以從適合于標記物質的公知方法中適當選擇，例如在標記 酶時，可以從戊二醛法、過碘酸交聯(lián)法、馬來酰亞胺交聯(lián)法、碳化二亞胺法、活化酯法等中適 當選擇；用放射性同位素標記時，可以從氯胺T法、乳過氧化物酶法等中適當選擇。需要 說明的是，關于標記抗血凝素抗體，由于針對各種型的抗體均有銷售，所以還可以使用市售 品。
[0019] 在本發(fā)明的方法中，通常使上述的固相化凝集素和標記抗血凝素抗體、與含有流 感病毒血凝素的樣本反應，清洗后測定與固相結合的標記。
[0020] 適用本發(fā)明的方法的樣本只要是含有流感病毒血凝素的樣本即可，可以是含有流 感病毒顆粒的樣本，也可以是從中提取血凝素而獲得的樣本。提取血凝素時，不管血凝素 的存在形式如何均可測定，無論是存在于病毒顆粒中還是以游離血凝素的形式存在均可測 定，測定精度也有所提高，因此優(yōu)選。提取血凝素時，可以使用陽離子型或陰離子型表面活 性劑（以下，將兩者統(tǒng)稱為"離子型表面活性劑"）。作為離子型表面活性劑的優(yōu)選例子，可 以列舉：十二烷基硫酸鈉（SDS)、十二烷基硫酸鋰（LiDS)、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)、 十六烷基三甲基氯化銨（CTAC)和氯化十六烷基吡啶（HPC)，特別優(yōu)選為十六烷基三甲基溴 化銨（CTAB)。離子型表面活性劑可以單獨使用，也可以將兩種以上組合使用。
[0021] 用離子型表面活性劑進行處理的條件優(yōu)選在樣本中添加離子型表面活性劑使終 濃度達到0. 1~2. 0%，在37°C下靜置或攪拌1~2小時左右，可以從病毒顆粒中提取血凝 素，但并不限于此。
[0022] 可以使固相化凝集素、樣本和標記抗血凝素抗體同時反應，也可以首先使固相化 凝集素與樣本反應，清洗后再與標記抗血凝素抗體反應，還可以先使樣本與標記抗血凝素 抗體反應形成免疫復合物，之后再與固相化凝集素反應。各反應可以在室溫下進行30分 鐘~120分鐘左右。反應系統(tǒng)中的血凝素的終濃度范圍通常是Ing/mL~I#g/mL左右，標 記抗血凝素抗體的終濃度范圍通常是0. 2~50 #g/mL左右。
[0023] 反應后，清洗固相，測定與固相結合的標記。作為清洗液，例如可以列舉：添加有 Tween(商品名）系表面活性劑等表面活性劑的緩沖液（例如磷酸緩沖液、磷酸緩沖液生理 鹽水、Tris鹽酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液生理鹽水）等。作為標記物質的檢測方法，根據(jù)使 用的標記物質而不同，例如在標記物質中使用生物素時，可以列舉下述方法等：經(jīng)由鏈霉親 和素等使過氧化物酶等酶與包含生物素作為標記物質的復合體結合，加入作為該酶的底物 的四甲基聯(lián)苯胺等顯色物質和過氧化氫水，再根據(jù)吸光度的變化測定酶反應產(chǎn)物的顯色程 度。另外，在標記物質中使用熒光物質或化學發(fā)光物質時，可以列舉測定反應后的溶液的熒 光或發(fā)光的方法等。
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