肽的回收方法、肽的檢測方法及試劑的制作方法
【專利說明】肽的回收方法、肽的檢測方法及試劑 【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及從血液等的液體樣品回收肽的方法、檢測肽的方法及用于這些方法的 試劑。 【【背景技術】】
[0002] 在血液中含有白蛋白或球蛋白等蛋白質（以下，也稱為血中蛋白質），肽多與血中 蛋白質結合。因此，在肽的檢測中，優(yōu)選從血中蛋白質游離。作為使肽游離的技術，可例舉 美國專利申請2012/0277407的技術。美國專利申請2012/0277407中記載的方法是通過加 熱處理含肽/白蛋白復合物的溶液而使肽非結合性的白蛋白形成自身聚集體，并將肽從白 蛋白游離的方法。 【
【發(fā)明內容】
】
[0003] 本發(fā)明的范圍僅由隨附的權利要求定義，且不受此發(fā)明概述內容的任何影響。
[0004] 【發(fā)明要解決的技術課題】
[0005] 本發(fā)明旨在提供以高回收率從液體樣品回收肽的方法、檢測肽的方法及用于這些 方法的試劑。
[0006] 【解決課題的技術方案】
[0007] 本發(fā)明人經銳意研宄的結果發(fā)現(xiàn)，通過混合含肽和血中蛋白質的復合物的液體樣 品與含特定的金屬離子或產生該金屬離子的金屬化合物的試劑，可以高回收率回收肽，從 而完成本發(fā)明。
[0008] 本發(fā)明提供肽的回收方法，其包括：
[0009] 通過混合含肽和血中蛋白質的復合物的液體樣品與含選自Zn2+、Ca2+、Li+、Ba 2+、 Mg2+、Mn2+及產生這些金屬離子之任一種的金屬化合物的至少I種的試劑而使所述肽自所述 血中蛋白質游離的工序，以及
[0010] 回收游離的所述肽的工序。
[0011] 另外，本發(fā)明提供肽的檢測方法，其包括：
[0012] 通過混合含肽和血中蛋白質的復合物的液體樣品與含選自Zn2+、Ca2+、Li+、Ba 2+、 Mg2+、Mn2+、及產生這些金屬離子之任一種的金屬化合物的至少I種的試劑而使所述肽自所 述血中蛋白質游離的工序，及
[0013] 檢測游離的所述肽的工序。
[0014] 另外，本發(fā)明提供用于所述的方法的試劑，其是含選自Zn2+、Ca2+、Li+、Ba2+、Mg 2+、 Mn2+、及產生這些金屬離子之任一種的金屬化合物的至少I種的試劑。
[0015] 【發(fā)明效果】
[0016] 通過本發(fā)明的肽的方法及試劑，可從含肽和血中蛋白質的復合物的液體樣品以相 比以往方法更高回收率回收所述肽。 【【附圖說明】】
[0017] 【圖1A】是SDS-PAGE凝膠的條帶強度的圖。
[0018] 【圖IB】是SDS-PAGE凝膠的條帶強度的圖。
[0019] 【實施方式】
[0020] 以下參照附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式。
[0021] 本發(fā)明的肽的回收方法（以下，也僅稱為"回收方法"）的游離工序是通過混合含 肽和血中蛋白質的復合物的液體樣品與含選自Zn 2+、Ca2+、Li+、Ba2+、Mg2+、Mn 2+及產生這些金 屬離子之任一種的金屬化合物的至少I種的試劑（以下也稱為"試劑"）而使所述肽自所述 血中蛋白質游離的工序。
[0022] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，液體樣品是活體樣品。作為活體樣品，例如，可例 舉從活體采集的血液等的體液。另外，從血液取得的血漿及血清也包括在活體樣品中。液 體樣品可稀釋而使用，稀釋率可由本領域技術人員適宜設定。
[0023] 在本說明書中，"血中蛋白質"是指白蛋白、球蛋白等，血液中存在的蛋白質。此血 中蛋白質在血液中與后述的肽結合而形成復合物，由本實施方式的游離工序游離肽。另外， 游離肽的血中蛋白質在游離工序中的處理中凝集而沉淀。
[0024] 在本發(fā)明的實施方式中，回收的肽不特別限定，可為天然起源的肽，也可為合成 肽。作為肽的長度，只要是可由本發(fā)明的方法回收的，就不特別限定。液體樣品中的多肽 之中尺寸比較大的（例如，血中蛋白質等）由本發(fā)明的游離工序中的處理凝集而沉淀，但 尺寸比較小的（例如，寡肽等）游離到液體中。此游離的多肽是可由本發(fā)明的方法回收的 "肽"。并非液體樣品中的全部的多肽被完全地沉淀或被完全地游離，多肽也含在沉淀的凝 集體中，并且也含在游離的成分之中。由于這樣的多肽也含在游離的成分（例如，上清）中， 變得可回收，所以其也包括在本發(fā)明的"肽"中。再有，根據本發(fā)明的方法，由于只要氨基酸 是130個殘基左右的肽，就游離到樣品中，所以適宜于回收不足130個殘基的肽，但不限于 此。再有，不僅是液體樣品中原本存在的多肽，在由本發(fā)明的方法處理的過程中片段化的多 肽也只要含在游離的成分中，就包括在本發(fā)明中的"肽"中。
[0025] 在本發(fā)明的實施方式中，肽的等電點不特別限定，肽可為堿性肽、酸性肽及中性肽 中的任何一種。
[0026] 在本發(fā)明的實施方式中，肽可為來源于在活體內生成的分子，也可為來源于從活 體外進入的分子。作為來源于在活體內生成的分子的肽，可例示在活體內生成的肽，或在活 體內生成的多肽的片段等。
[0027] 在本發(fā)明的實施方式中，肽也可為血液中存在的生物標志物。
[0028] 作為那樣的生物標志物的肽，可例舉例如胃促生長素、腦性鈉利尿肽（BNP)、腎上 腺皮質刺激激素（ACTH)、心房性鈉利尿肽（ANP)、緩激肽、α -內啡肽、C-肽、C3f片段、ITIH4 片段、Αβ肽等，但不限于這些。即，在本發(fā)明中，在游離的肽中也可含至今未被鑒定的具有 新的氨基酸序列的肽。
[0029] 當以生物標志物作為檢測對象時，本實施方式的方法可用于例如取得特定的疾病 的存在或疾病的進行度的信息。即，可以推定，由本實施方式的方法從活體樣品回收作為生 物標志物的肽，通過對其進行定性及/或定量檢測，可以取得能成為判斷疾病的存在或疾 病的進行度時的指標的信息。
[0030] 另外，在本發(fā)明的實施方式中，肽也可為向活體施用的多肽、其代謝物、或者這些 的片段。此時，本實施方式的方法可用于例如取得對藥劑感受性的信息。即，可以推定，由 本實施方式的方法從活體樣品回收作為藥劑向活體施用的多肽或其代謝物，通過對其進行 定性及/或定量檢測，可以取得能成為判斷所述藥劑的感受性等時的指標的信息。
[0031] 另外，在本發(fā)明的實施方式中，肽也可為不是檢查對象的活體來源的，而是從活體 外侵入活體內的。作為例，可例舉病原體（細菌、病毒等）來源的肽等。此時，本實施方式 的方法可例如為了取得對于向病原體的感染的信息而利用。即，可以推定，由本實施方式的 方法從活體樣品回收構成病原體的蛋白質來源的肽或病原體生成的毒素（例如志賀菌毒 素等）來源的肽，通過對其進行定性及/或定量檢測，可以取得能成為判斷向所述病原體的 感染時的指標的信息。
[0032] 在本發(fā)明的實施方式中，"試劑"只要是含下述的金屬離子的或者含在水或水性介 質中溶解而產生下述之任一種的金屬離子的金屬化合物的，就不特別限定，可為固體，也可 為溶液狀。
[0033] 在本發(fā)明的實施方式中，"金屬離子"選自2112+、0& 2+、1^+、8&2+、1%2+及此2+。在其中 也特別優(yōu)選Zn 2+、Ca2+、Li+、Ba2+及Mg 2+。如上所述，這些金屬離子可作為離子結合性的化合 物等，在固體或溶液狀的液中，以離子的狀態(tài)含在試劑中，但優(yōu)選例如作為所述金屬離子的 氯化物、溴化物、硫代氰化物等是固體，在其中也特別優(yōu)選作為ZnCl 2& CaCl 2含有。
[0034] 試劑是固體時，該試劑可為可產生所述列舉的各金屬離子的金屬化合物，也可為 這樣的金屬化合物之中的至少2種的混合物，在不妨礙本發(fā)明的實施的范圍內，也可再含 所述金屬化合物以外的成分。
[0035] 試劑是溶液狀時，該試劑是含所述列舉的金屬離子之中的至少1種的溶液，在不 妨礙本發(fā)明的實施的范圍內，也可再含所述列舉的金屬離子以外的成分。溶劑只要適宜于 所述金屬化合物的溶解，就不特別限定，可由本領域技術人員適宜選擇。作為那樣的溶劑， 可例舉例如水、磷酸緩沖生理鹽水（PBS)等。
[0036] 在本發(fā)明的實施方式中，相對于液體樣品的試劑的添加量只要是金屬離子的最 終濃度相比血中的金屬離子濃度變得更高的量，就不特別限定，可由本領域技術人員適宜 設定。那樣的添加量優(yōu)選添加至金屬離子的最終濃度達〇. 01~300mM、更優(yōu)選為0. 5~ 2〇〇mM、再優(yōu)選為5~lOOmM。
[0037] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的回收方法還包括加熱處理由液體樣品和 試劑的混合得到的混合液的工序?；旌弦旱募訜崽幚碇械臏囟群蜁r間只要在混合液中的肽 不因熱而完全變性的范圍內即可。其中"肽完全地變性"是指肽變性為不可能檢測的程度。
[0038] 這樣的加熱處理溫度可由本領域技術人員適宜設定，但優(yōu)選在40°C以上200°C以 下進行，更優(yōu)選為50°C以上180°C以下，再優(yōu)選在65°C以上160°C以下進行。
[0039] 加熱處理時間另外也可由本領域技術人員適宜設定，優(yōu)選進行30秒鐘~5分鐘、 更優(yōu)選進行1~3分鐘。
[0040] 加熱處理中的升溫速度不特別限定，可由本領域技術人員適宜設定。
[0041] 在本發(fā)明的實施方式中，加熱處理的方法只要是可用所述的溫度加熱混合液的方 法，就不特別限定，選自現(xiàn)有技術中公知的方法。作為那樣的方法，可例舉例如由從外部的 熱傳導加熱、由微波加熱等。
[0042] 另外，在本發(fā)明的實施方式中，用于加熱處理的裝置只要是可一邊調節(jié)混合液的 溫度一邊加熱的裝置，就不特別限定，可例舉例如水熱反應器、微波照射裝置等。
[0043] 由上述的工序，從混合液中的肽和血中蛋白質的復合物，形成被認為是血中蛋白 質的自身聚集體的沉淀物。在專利文獻1中報告，認為白蛋白的自身聚集體因熱變性而使 高級結構發(fā)生變化，幾乎失與肽結合的能力。從而，不旨在受特定的理論約束，作為可說明 本發(fā)明的回收方法的機制的1個假說，在本發(fā)明的回收方法中，在形成被認為是血中蛋白 質的自身聚集體的沉淀物時，認為肽從血中蛋白質游離