應用iTRAQ技術研究水稻響應稻瘟病菌侵染蛋白質組變化的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種應用iTRAQ技術研宄水稻響應稻瘟 病菌侵染蛋白質組變化的方法。
【背景技術】
[0002] 植物抗病性及抗病機制研宄是當今植物病理學和植物抗病育種研宄的熱點和焦 點。在自然情況下，植物經常處于生物脅迫或非生物脅迫之中。當受到外來病原菌侵染 時，植物將通過改變自身蛋白質組的表達模式或酶類的活性等方式以抵制病原物的入侵。 植物的抗病性的產生涉及到一系列復雜的信號傳導過程，目前已有研宄從各種植物中發(fā)現 與鑒定了一些與病原物侵染相關的抗病途徑被激活。
[0003] 但目前多數研宄集中在利用基因芯片、基因表達序列分析等技術分析植物與病原 物互作過程中激活的抗病信號傳導途徑，由于這些技術主要是基于mRNA水平的變化，不能 真實的反映蛋白水平的變化，不利于揭示植物與病原物的具體互作機制。
[0004] 蛋白質是生理功能的執(zhí)行者和生命現象的直接體現者，其豐度、結構、穩(wěn)定性、亞 細胞定位及與其他生物大分子的相互作用時刻處于動態(tài)變化之中，對整個蛋白質組進行功 能分析、鑒定及其翻譯后修飾的研宄，能更加客觀準確地揭示生命現象。蛋白質組學也很早 被用于水稻與稻瘟病菌互作的研宄中，但大多數還是基于2D電泳分離和質譜鑒定聯(lián)合應 用，屬于對于一個細胞或組織的蛋白質進行的定性研宄，僅能確定蛋白質的身份但不能對 蛋白質的功能給出最終定論。因此，這些被鑒定出來的蛋白數量、種類有限，很少被繼續(xù)深 入的研宄，也未能被有效的用于水稻的抗病育種中。
[0005] 事實上，蛋白質在濃度上的變化對于實現其在細胞中的功能來說極其重要，這些 濃度的變化往往能揭示細胞的真實生命代謝過程。因此，在蛋白質組學研宄中，對蛋白質的 相對和絕對濃度進行測量顯得尤為重要。相對和絕對定量同位素標記（isobarictagsfor relativeandabsolutequantitation，iTRAQ)是由美國應用生物系統(tǒng)公司在2004年推 出的研宄蛋白質組的新技術，可以同時對1個基因組表達的全部蛋白質或1個復雜的混合 體系中的所有蛋白質進行精確定量和鑒定，不僅降低了實驗過程中所引入的技術誤差，還 克服了 2-DE不能對低豐度、極大和極小、極堿性和疏水蛋白進行有效分離的問題，使得全 面分析蛋白質組的變化成為可能。iTRAQ技術已成為目前蛋白質組學定量方法中一個十分 重要的技術，其作用已經在許多生物體和組織研宄中得到證明，但尚未見到該技術用于水 稻與稻瘟病互作的差異蛋白質組學研宄的報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服上述現有技術中存在的缺點與不足，提供一種應用iTRAQ 技術研宄水稻響應稻瘟病菌侵染蛋白質組變化的方法。用以克服現有技術的研宄效果不準 確的問題。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：一種應用iTRAQ技術研宄水稻響應稻瘟病 菌侵染蛋白質組變化的方法，通過定量蛋白質組學技術以較為全面、準確的分析抗、感病水 稻品種響應稻瘟病侵染后的蛋白質組變化，所述定量蛋白質組學技術為iTRAQ技術。
[0008] 所述的應用iTRAQ技術研宄水稻響應稻瘟病菌侵染蛋白質組變化的方法，包含以 下步驟：
[0009] A?植物材料與葉片蛋白的提?。?br>[0010]B.對步驟A所得的蛋白質樣品進行進一步FASP酶解、肽段標記、SCX分級及LC-MS質譜分析；
[0011] C.對上步所得的質譜鑒定結果進行數據查庫、定量分析，獲取水稻-稻瘟病菌互 作過程中整個蛋白質組的變化情況。
[0012] 步驟A中所述植物材料與葉片蛋白的提取，具體步驟為分別取接種稻瘟病菌前后 Oh和24h不同時間點的抗病材料及感病材料葉片，進行液氮研磨、離心、裂解處理，并進行 蛋白質量的SDS-PAGE電泳檢測。
[0013] 步驟B中所述步驟是在肽段定量后各組樣品分別取約90yg，按照AB公司試劑盒 iTRAQReagent_8plexMultiplexKit(ABSCIEX)說明書進行FASP酶切、肽段標記后進行 的SCX預分級，并進一步進行質譜鑒定。
[0014] 步驟C中所述步驟是將經質譜分析及Mascot查庫后的結果合并后以Peptide FDR< 0. 01篩選過濾；對共同鑒定到的蛋白進一步進行GO聚類分析，選取差異倍數>1. 2 或〈0. 8、p-value〈0. 05的蛋白進行進一步分析，獲取水稻-稻瘟病菌互作過程中整個蛋白 質組的變化情況。
[0015] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟A的具體步驟為：
[0016] 1)對抗病材料及感病材料的3. 5-4葉期的水稻幼苗進行稻瘟病菌的接種，接種 0h、24h后取樣，迅速置于液氮中冷卻后置于-80°C中保存?zhèn)溆茫?br>[0017] 2)取水稻組織樣品，用液氮研磨成粉末并轉入50ml離心管中，加入25ml提取 液-20°C沉淀lh;離心10000rpm，45min，棄上清；空氣干燥后按10:1體積加入SDTbuffer， 禍旋混勾，沸水浴5min;超聲破碎后沸水浴5min，離心取上清，利用BCA法進行蛋白質定 量；
[0018] 3)取20yg蛋白質樣品，按體積比5:1加入5X上樣緩沖液，沸水浴5min，離心 14000g20min，取上清進行12. 5%SDS-PAGE電泳；恒流14mA，電泳90min后對膠進行考馬 斯亮藍染色。
[0019] 步驟2)中所述的提取液為TCA與丙酮體積比為1:9,添加有65mMDTT。
[0020] 步驟 2)中所述的SDTbuffer的組分為 4%SDS，ImMDIT，150mMTris-HCl，pH8. 0。
[0021] 步驟2)中所述的超聲破碎的條件為80w，超聲10s，間歇15s，共10次。
[0022] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟B的具體步驟為：
[0023] (1)取400yg樣品，加入65mMDTT，沸水浴5min，冷卻至室溫；加入200y1UA buffer混勾，轉入超濾離心管，離心14000g，15min;加入200ylUAbuffer離心14,000g， 15min，棄濾液；加入 100y1IAA，600rpm振蕩lmin，避光室溫 30min，離心 14000g，lOmin; 加入 100ulUAbuffer，離心 14000g，10min重復 2 次；加入 100ylDissolutionbuffer，離 心 14000g，lOmin重復 2 次；加入 40y1Trypsinbuffer，600rpm振蕩lmin，37°C16_18h; 換新收集管，離心14000glOmin，取濾液，0D28(I肽段定量；
[0024] (2)肽段標記及SCX分級：
[0025] 各組樣品分別取約90yg，按照AB公司試劑盒iTRAQReagent-8plex MultiplexKit(ABSCIEX)說明書進行樣品標記；將標記后的所有肽段混合，采用AKTA PurifierlOO(GEHealthcare)儀器進行SCX預分級，收集穿流及洗脫fraction30份，根據 SCX色譜圖每組樣品合并成10份，凍干后C18Cartridge(Sigma)脫鹽；
[0026] (3)質譜分析鑒定：
[0027] 每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)EasynLC進行分離；緩沖液:A液為0. 1 % 甲酸水溶液，B液為0. 1 %甲酸乙腈水溶液；色譜柱以95 %的A液平衡；樣品由自動進樣 器上樣到上樣柱ThermoscientificEASYcolumn(2cm*100tim5um-C18)，再經分析柱 ThermoscientificEASYcolumn(75ym*100mm3ym-C18)分離，流速為 250nl/min;相關 液相梯度如下：〇min-100min，B液線性梯度從0%到35% ;100min-108min，B液線性梯度從 35%到100% ;108min-120min，B液維持在100% ;然后每份樣品經毛細管高效液相色譜分 離后用Q-Exactive質譜儀（ThermoFinnigan)進行質譜分析。
[0028]步驟（1)中所述的UAbuffer為 8MUrea，150mMTris-HCl，pH8. 0。
[0029] 步驟（1)中所述的Trypsinbuffer的配方為在40y1裂解液中添加4yg胰蛋白 酶。
[0030] 步驟（3)中所述的乙腈水溶液中乙腈為84%。
[0031] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟C的具體步驟為：
[0032] 原始數據經降噪、去同位素步驟后獲得峰圖列表；同時建立參考蛋白序列數據庫， 使用蛋白質鑒定軟件Mascot2. 2對參考數據庫進行搜素進行肽段及蛋白質的鑒定，進一 步對鑒定質量評估，并對基本信息、定量信息及差異蛋白分別進行分類統(tǒng)計；將差異倍數 >1. 2倍或〈0. 8倍、且經統(tǒng)計檢驗其p-Value〈0. 05的蛋白確定為差異蛋白，獲取水稻-稻瘟 病菌互作過程中整個蛋白質組的變化情況。
[0033] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，對所有鑒定到的差異蛋白進行G0功能注釋分 析（http://www.geneontology.org);進一步通過Pathway分析，確定蛋白參與的主要生理 生化代謝途徑和信號傳導途徑；最后對各蛋白在各樣品之間的相對含量進行比較，從而獲 得一些感興趣的重要蛋白。
[0034] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟C之后進一步利用RT-PCR技術對所鑒定出 的差異蛋白進行驗證。
[0035] 本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及效果：
[0036] 本發(fā)明能夠較完整的鑒定出參與水稻-稻瘟病菌互作過程中的差異蛋白，本發(fā)明 實施例利用該方法鑒定了一些水稻響應稻瘟病侵染過程中的發(fā)生變化的蛋白；本發(fā)明方法 對深入揭示水稻-稻瘟病互作機制提供了一個方法借鑒；在利用轉基因技術培育抗稻瘟病 品種上具有重要的參考價值。其優(yōu)點和效果分述一下：①能快速和有效地篩選到與水稻抗 病相關聯(lián)的候選基因；②本發(fā)明很好的利用iTRAQ這一高通量、準確的蛋白質組學研宄手 段來研宄與水稻抗病相關的候選基因；③可以廣泛應用于植物抗病等性狀的研宄和開發(fā)并 且結合轉基因技術來培育抗病性強的植物（作物）新品種。
【附圖說明】
[0037] 圖1.水稻葉片總蛋白的質量檢測圖；
[0038] 圖2.不同處理之間差異表達蛋白比對圖；其中：A為全部差異蛋白，B為上調差異 蛋白，C為下調差異