一種雌二醇磁性分子印記納米粒電化學(xué)傳感膜的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雌二醇磁性分子印記納米粒電化學(xué) 傳感膜（MMIES)的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 17-β雌二醇（E2)作為內(nèi)分泌干擾物之一，有研宄表明兒童性早熟，男性前列腺 癌，婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升都與食品中的雌激素殘留有關(guān)。此外，它還會影響女 性的生理規(guī)律，甚至?xí)?dǎo)致不孕。痕量級別的雌二醇就能夠引起體液免疫和細(xì)胞免疫的失 調(diào)，導(dǎo)致生殖免疫、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的病變。但是由于雌激素生產(chǎn)過程中的殘留和非法添 加等原因，往往造成環(huán)境污染和食品安全等問題出現(xiàn)。為了保證廣大消費(fèi)者的身體健康，規(guī) 范食品市場，建立一個可靠快速的雌激素檢測方法是非常必要而又迫切的問題。
[0003] 電化學(xué)傳感器是一種重要的電子器件，因其設(shè)計(jì)簡單、靈敏度高、價(jià)格低廉、可實(shí) 現(xiàn)人體實(shí)時(shí)檢測、可滿足臨床診斷、環(huán)境分析、食品分析和產(chǎn)品檢測需要等優(yōu)點(diǎn)，越來越受 到人們的關(guān)注。分子印記技術(shù)是制備具有特異選擇性或?qū)Ｒ贿x擇性聚合物的技術(shù)。其最顯 著的三大特點(diǎn)為：構(gòu)效預(yù)定性，特異識別性和廣泛適用性。目前磁性分子印記納米傳感膜及 電化學(xué)檢測復(fù)雜體系中雌二醇相關(guān)研宄未見報(bào)道。
[0004] 食品、保健品由于自身成分的復(fù)雜性，以及添加劑種類的多樣性和未知性等問題， 對其含有雌二醇的分析檢測提出了更高的要求。已有文獻(xiàn)報(bào)道的檢測方法有：HPLC、LC-MS、 GC-MS等。這些傳統(tǒng)的方法雖然也能實(shí)現(xiàn)對雌二醇的測定，但往往由于樣品基質(zhì)復(fù)雜而需要 經(jīng)過繁瑣的樣品前處理，這大大影響了目標(biāo)物檢測的準(zhǔn)確性和快捷性。近來基于納米材料 和納米技術(shù)的生物傳感器和電化學(xué)傳感器因具有快速、靈敏、穩(wěn)定的特點(diǎn)成為熱門研宄領(lǐng) 域。特別是分子印記電化學(xué)傳感器（MIES)因具有高靈敏度和選擇性成為一種極具前景的 電化學(xué)仿生傳感器，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜體系微痕量目標(biāo)物的識別和靈敏檢測。MIES往 往需要復(fù)雜的電極修飾和電化學(xué)聚合傳感膜形成過程，制備和操作技術(shù)要求高，不利于推 廣和應(yīng)用。MIPs電聚合傳感膜雖然可多次重復(fù)使用，但電極拋光再生處理時(shí)間長，電極利用 率低，電極磨耗導(dǎo)致使用壽命有限。另外，MIPs結(jié)構(gòu)對電化學(xué)響應(yīng)有明顯影響，構(gòu)建優(yōu)良 電傳導(dǎo)和催化活性的MIPs對提高M(jìn)IES檢測靈敏度有重要作用。因此設(shè)計(jì)和制備電活性結(jié) 構(gòu)MIPs，研宄具有普適性強(qiáng)的高靈敏度和選擇性MIES將有顯著意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于雌激素電化學(xué)檢測的磁性分子印記納米傳感膜的 制備方法，該法首次結(jié)合電化學(xué)傳感技術(shù)、磁性吸附技術(shù)、分子印記納米粒三者的優(yōu)點(diǎn)構(gòu)筑 以雌二醇為代表的磁性分子印記納米電化學(xué)傳感膜，實(shí)現(xiàn)了對復(fù)雜基質(zhì)中微痕量雌二醇快 速檢測，本方法測定靈敏度高，對目標(biāo)物選擇性強(qiáng)，操作簡單，具有良好的普適性。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到：
[0007] 一種雌二醇磁性分子印記納米粒電化學(xué)傳感膜制備方法，其特征在于該方法包括 以下步驟：
[0008] a)分子印記自組裝溶液的制備：在Fe3O4OAu-GSH納米粒中加入E2-乙醇溶液，攪 拌反應(yīng)，溶液通氮?dú)獬鹾蠹尤氡桨?HCl溶液，避光攪拌均勻；
[0009] b)聚合反應(yīng)：在步驟a)得到的溶液中加入引發(fā)劑過硫酸銨（APS)，避光攪拌反 應(yīng)；
[0010] c)洗脫模板分子：將步驟b)得到的溶液，磁性分離去除上清液，水洗，加 HCl-乙 醇溶液處理，脫去模板分子，得Fe3O4IgAu-GSH-PANI磁性分子印跡納米粒（MMIPs);
[0011] d)富集模板分子：將制得的MMIPs置于E2-PBS溶液中，攪拌吸附，得到E2-MMIPS ;
[0012] e)電化學(xué)檢測：將含E2-MMIPs的溶液置于反應(yīng)池中，用磁性玻碳電極（MGCE)磁 性吸附5min~lh，使得電極表面成膜。
[0013] 在步驟a)中，每5mg~20mg的Fe3O4OAu-GSH納米粒，加入5mL~50mL濃度范圍 為lmmol/L~20mmol/L的E2-乙醇溶液，所使用的乙醇為無水乙醇，反應(yīng)時(shí)間1~20h。加 入苯胺-HCl溶液前通氮?dú)獾臅r(shí)間為1~50min。
[0014] 在苯胺-HCl溶液中，苯胺和HCl的體積比范圍為I :10~20, HCl的濃度范圍為 0. 05mol/L~5mol/L。溶液的酸度增加，電子轉(zhuǎn)移速率增大，質(zhì)子化作用加強(qiáng)，有利于聚苯 胺的合成，但是酸度過大，會使得磁性分離難度加大，最后得到的MMIPs導(dǎo)電性能減弱。本 實(shí)驗(yàn)中，苯胺和HCl的最佳摩爾濃度比為1:2. 5。
[0015] 步驟a)的整個過程的反應(yīng)溫度為5~50°C。
[0016] 在步驟b)中，過硫酸按以過硫酸按溶液的形式加入，每含5mg~20mg的Fe3O 4O Au-GSH納米粒的分子印記預(yù)組裝溶液中，加入濃度范圍為IOmmo I/L~500mmo I/L的過硫酸 銨溶液〇. ImL~5mL，聚合反應(yīng)時(shí)間為2~20h，反應(yīng)溫度為0~50°C。聚合時(shí)間影響印記 的效果，聚合時(shí)間過短，Ip的響應(yīng)值很弱，聚合反應(yīng)時(shí)間過長，E2嵌入過深，Ip的響應(yīng)值也 會減小。本實(shí)驗(yàn)中的最佳聚合反應(yīng)時(shí)間為6h。
[0017] 在步驟c)中，HCl-乙醇溶液的濃度范圍為0· 05mol/L~2. Omol/L，攪拌時(shí)間為 5min~2h，可在5~50°C溫度條件下處理。
[0018] 在步驟d)中，MMIPs的加入量質(zhì)量范圍為5mg~50mg，E2-PBS濃度為0· 01~ 2. Omol/L，攬拌時(shí)間為5min~5h。
[0019] Fe3O4OAu-GSH納米粒的制備包括制備Fe3O4磁性納米粒，F(xiàn)e 304表面接NH 2，制備 Fe3O4OAu納米粒，連接功能基團(tuán)疏基步驟。
[0020] 制備Fe3O4磁性納米粒步驟具體如下：
[0021] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)及磁力攪拌下，將FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20的混合水溶液，加熱至 20-80°C后，逐滴加入NH3 · H2O反應(yīng)20~60min，磁性分離去上清液，收集反應(yīng)沉淀物水洗， 獲得Fe3O 4磁性納米粒。其中，F(xiàn)eCl 3 ·6H20與FeCl2 · 4H20的摩爾比為3:1~I: I，F(xiàn)eCl3 · 6H20 在混合水溶液的體積濃度為0. 05~0.1 mmol/mL，每100_300ml混合水溶液加入NH3 ·Η20的 體積范圍為5mL~20mL。
[0022] 在Fe3O4表面接NH 2步驟具體如下：取Fe 304磁性納米粒，加入APTES-乙醇溶液，溫 度為0~80°C攪拌反應(yīng)l_48h，磁性分離去上清液，加乙醇清洗溶解，得到APTES包裹Fe 3O4 納米粒。其中，APTES-乙醇的體積濃度范圍為0. 1%~5%，每5-20mgFe304磁性納米粒加 入的體積范圍為5mL~20mL。
[0023] 制備Fe3O4OAu納米粒步驟具體如下：取I-IOOmg APTES包裹Fe3O4納米粒，加入 0.1 -10mL體積濃度為1% -5%的HAuC14水溶液和I. 4-140mL二次蒸餾水，超聲分散后，繼 續(xù)超聲同時(shí)加入濃度范圍為2mmol/L~20mmol/L NaBH4直至溶液顏色由黃褐色變?yōu)樽鲜砩?得到Fe3O4OAu納米粒溶液，反應(yīng)溫度為10~100°C。在制備Fe 3O4OAu納米粒步驟中，NaBH4 在反應(yīng)中作還原劑，將金離子還原成金納米粒包裹在Fe3O4的表面，配制的NaBH 4溶液濃度 不宜過高，且滴加速度應(yīng)緩慢同時(shí)超聲分散，否則會使還原反應(yīng)迅速進(jìn)行，生成的金納米粒 不能均勻地包裹在Fe 3O4的表面。
[0024] 在上述 Fe3O4OAu 納米粒溶液中，加入 0. 5mL ~30mL 5mmol/L ~100mmol/L GSH， 攪拌反應(yīng)l-48h，反應(yīng)溫度為5~50°C。磁性分離去上清液，水洗，得到Fe304@Au/GSH納米 粒。加入的GSH也可以是其他含巰基（-SH)的氨基酸，如半胱氨酸。
[0025] 上述雌二醇磁性分子印記納米粒電化學(xué)傳感膜的制備方法，具體可包括以下步 驟：
[0026] 1、磁性分子印記納米粒電化學(xué)傳感膜的制備
[0027] a)制備Fe3O4納米粒：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱FeCl 3 · 6H20與FeCl2 · 4H20的混合水 溶液，劇烈攪拌的條件下滴加 NH3 · H2O反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后磁性分離去上清液，水洗沉淀物得 Fe3O4磁性納米粒。
[0028] b) Fe3O4表面接-NH 2:取Fe 304納米粒，加入APTES-乙醇溶液，攪拌反應(yīng)，磁性分離 去上清液，加乙醇清洗溶解，得到APTES包裹Fe 3O4納米粒。
[0029] c)制備Fe3O4OAu納米粒：取步驟b)中得到的APTES包裹Fe3O 4納米粒，加入HAuCl4 和適量的二次蒸餾水，超聲分散，繼續(xù)超聲同時(shí)加入NaBH4直至溶液顏色由黃褐色變?yōu)樽?薯色；
[0030] d)連接功能基團(tuán)-疏基：在步驟c)得到的溶液中，再加入GSH攪拌反應(yīng)，磁性分 離去上清液，水洗；得到Fe3O 4OAu-GSH納米粒。
[0031] e)分子印記自組裝溶液：將得到的Fe3O4OAu-GSH納米粒中加入E2-乙醇溶液，攪 拌反應(yīng)，溶液通氮?dú)獬鹾蠹尤氡桨?HCl溶液，避光攪拌均勻；
[0032] f)聚合反應(yīng)：在步驟e)得到的溶液中加入引發(fā)劑過硫酸銨（APS)，避光攪拌反 應(yīng)；
[0033] g)洗脫模板分子：將步驟f)得到的溶液，磁性分離去除上清液，水洗，加 HCl-乙 醇溶液處理，脫去模板分子，得Fe3O4IgAu-GSH-PANI磁性分子印記納米粒（MMIPs);
[0034] h)富集模板分子：將制得的麗IPs置于E2-PBS溶液中，攪拌吸附，得到E2-MMIPS ;
[0035] i)電化學(xué)檢測：將步驟h)中含E2-MMIPs的溶液置于反應(yīng)池中，用磁性玻碳電極 (MGCE)磁性吸附，進(jìn)行電化學(xué)測定。
[0036] 通過以下方法對本發(fā)明磁控電化學(xué)傳感膜進(jìn)行檢測：
[0037] 電化學(xué)檢測方法和條件：
[0038] 循環(huán)伏安法（CV)法：檢測電位范圍為-0. 2~0. 6V，掃描速率為IOOmV 測試 底液為 〇· Imol · L-1KCl 和 Immol · T1K3Fe (CN) 6溶液。
[0039] 差示脈沖法（DPV)法：檢測電位范圍為-0. 2~0. 8V，掃描速率為50mV · s'電位 增量為〇. 005V，振幅為0. 05V，脈沖寬度為0. ls，采樣寬度為0. 02s，靜止時(shí)間為2s。測試前 電極用Al2O3粉末拋光、乙醇、蒸餾水超聲清洗、氮?dú)獯蹈伞y試底液為0. 05mol · L -1PBS (pH 7· 0)-0· Imol · T1KCl 溶液。
[0040] 樣品測定：以測定奶粉中的雌二醇為例，稱取某奶粉粉末lg，以20mL乙醇超聲溶 解Ih后，12000rpm離心5min，取上清液，真空干燥。干燥后用5mL乙醇復(fù)溶，取0. 5mL用 pH7. 0磷酸鹽緩沖液稀釋到5mL，將實(shí)施例1方法制得的MMIPs置于溶液中攪拌吸附30min。 MGCE在得到的E2-MMIPS溶