Edc殘留的hplc-elsd檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及EDC的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及EDC殘留的HPLC-ELSD檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在現(xiàn)今較為穩(wěn)定的化學(xué)交聯(lián)方法中，碳二亞胺的交聯(lián)體系越來越受到關(guān)注，因?yàn)?其本身的毒性小，交聯(lián)效果迅速，結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)都極好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)采用甲醛，戊二醛等 交聯(lián)方式所帶來的毒性問題。相比于諸如熱交聯(lián)等物理交聯(lián)方法而言，碳二亞胺的交聯(lián)體 系更為穩(wěn)定，交聯(lián)出的產(chǎn)品更加符合實(shí)際應(yīng)用。
[0003] 在交聯(lián)工藝完成之后，交聯(lián)劑本身的殘留定量檢測(cè)就成為一個(gè)亟待解決的問題， 在 ICH(The International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use 人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào) 會(huì)議）于其《Q3AR2 :新原料藥中雜質(zhì)》中規(guī)定藥品中所涉及到的雜質(zhì)必須要進(jìn)行研宄和檢 測(cè)。
[0004] EDC(1_(3_ 二甲基氨丙基）_3_ 乙基碳二亞胺，l-(3-Dimethylaminopropyl)-3_et hylcarbodiimide hydrochloride，EDC or EDAC)是碳二亞胺系列中活性較高的脫水劑，主 要用作生物多糖、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸合成、高分子改性和有機(jī)合成的縮合劑和交聯(lián)劑。在 醫(yī)療器械領(lǐng)域，生物高分子材料發(fā)展如火如荼，應(yīng)用前景巨大，比如現(xiàn)今較為熱門的膠原蛋 白研宄領(lǐng)域，該領(lǐng)域中，膠原蛋白膜可以作為包裝膜、皮膚替代物、角膜、面膜用于食品、生 物醫(yī)學(xué)、化妝品等不同行業(yè)，熱門的產(chǎn)品包括皮膚修復(fù)膠原海綿、膠原硬腦膜補(bǔ)等。盡管研 宄時(shí)日漫長，而在產(chǎn)品交聯(lián)方面還是存在著較大的問題，傳統(tǒng)交聯(lián)劑諸如甲醛，戊二醛等毒 性巨大，EDC作為一種化學(xué)交聯(lián)劑，通過控制交聯(lián)劑的用量可以實(shí)現(xiàn)對(duì)膠原蛋白等生物大分 子制品交聯(lián)度的精確控制，能夠更好地滿足于產(chǎn)品安全性以及有效性的需求，是未來大生 產(chǎn)中交聯(lián)劑發(fā)展的主要方向之一。
[0005] 在2010版中國藥典中，EDC的殘留檢測(cè)采用分光光度法，分光光度法本身專一性 不高，許多物質(zhì)均存在紫外吸收，對(duì)于樣品中就存在吸光的物質(zhì)很難排除，而HPLC法對(duì)于 樣品的分析專一性更強(qiáng)，分光光度法中使用吡啶以及二甲基巴比妥酸等有毒有機(jī)試劑對(duì)殘 留的EDC進(jìn)行化學(xué)修飾，過程繁瑣，且不利于人員和環(huán)境安全。也有報(bào)道顯示采用液質(zhì)聯(lián)用 能夠做到更為優(yōu)良的檢測(cè)限，檢測(cè)出痕量EDC殘留，但該方法成本較高，不是所有企業(yè)或者 研宄學(xué)者能夠負(fù)擔(dān)，應(yīng)用上受到極大限制；況且痕量檢測(cè)對(duì)于常規(guī)的研發(fā)和企業(yè)實(shí)際生產(chǎn) 的意義不大。
[0006] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微量EDC殘留的 HPLC-ELSD檢測(cè)方法。
[0008] 本發(fā)明提供的EDC殘留的HPLC-ELSD檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0009] (1)取待測(cè)物進(jìn)行預(yù)處理，將待測(cè)物中的EDC提取出并富集到溶劑中，得到待測(cè)樣 品；
[0010] (2)采用HPLC-ELSD檢測(cè)法檢測(cè)待測(cè)樣品中的EDC含量。
[0011] 進(jìn)一步地，所述步驟⑵中包括如下子步驟：
[0012] (2a)配制EDC標(biāo)準(zhǔn)液；
[0013] (2b)對(duì)EDC標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行HPLC-ELSD檢測(cè)，條件為：
[0014] HPLC 條件：
[0015] 色譜柱：采用反相C18柱；
[0016] 色譜柱溫度：10~30°C ;
[0017] 流動(dòng)相：流動(dòng)相分為水相和有機(jī)相，水相為甲酸水溶液或TFA水溶液，有機(jī)相為甲 醇；
[0018] ELSD條件：霧化器溫度：KKTC~105°C，蒸發(fā)室溫度與霧化器溫度一致，霧化器氣 體：氮?dú)猓瑲怏w流速：1. 6~I. 8L/min ;
[0019] (2c)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，按（2b)中的條件對(duì) 待測(cè)樣品檢測(cè)，計(jì)算待測(cè)樣品的峰面積，代入所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出待測(cè)樣品中EDC 的含量。
[0020] 優(yōu)選地，色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18 柱，規(guī)格為 4. 6mmX 250mmX 5um〇
[0021] 優(yōu)選地，水相為0.1 % (v/v)的甲酸水溶液。
[0022] 優(yōu)選地，所述流動(dòng)相中0.1 (v/v) %甲酸水溶液和甲醇的體積比90~95:10~5。
[0023] 優(yōu)選地，色譜柱溫度為25 °C。
[0024] 進(jìn)一步地，HPLC條件中還包括：
[0025] 進(jìn)樣量：50ul ;
[0026] 流動(dòng)相流速：lml/min。
[0027] 優(yōu)選地，霧化器溫度為105°C。
[0028] 進(jìn)一步地，步驟（2a)中的配制方法為：稱取0. 0965gEDC加水溶解并定容至 l〇〇ml，再取Iml至IOml容量瓶，加水定容至刻度，得到96. 5mg/L EDC對(duì)照品貯備液；
[0029] 標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度配置：取96. 5mg/L的EDC對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別移取10ml、20ml、 30ml、40ml、50ml，分別定容至 100ml，得到濃度分別 9. 65ug/ml、19. 3ug/ml、28. 95ug/ml、 38. 6ug/ml、48. 25ug/ml的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)液。
[0030] 步驟（I)中，若所述待測(cè)物為膠原蛋白，所述預(yù)處理的方式為：取膠原蛋白膜樣品 I. 5000g，然后將樣品剪成為小片，加無水乙醇50ml，在37. 5°C下浸提lh，然后將樣品擠干， 并棄去樣品，將浸提后得到的無水乙醇液于37. 5°C下進(jìn)行真空干燥直至乙醇全部除去，再 添加 Iml純化水溶解干燥后的樣品作為待測(cè)樣品液。對(duì)膠原蛋白采用上述預(yù)處理方式處 理，EDC殘留的檢測(cè)限度更小、檢測(cè)結(jié)果更加精確。此外，針對(duì)其他類型的樣品（如疫苗等 液體產(chǎn)品）的EDC殘留檢測(cè)，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力選擇與之相應(yīng)的預(yù)處理方式。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0032] (I)ELSD檢測(cè)時(shí)樣品不要求帶有發(fā)色團(tuán)或熒光基團(tuán)，樣品檢測(cè)前的預(yù)處理方式不 需要采用二甲基巴比妥酸和吡啶進(jìn)行光學(xué)修飾，杜絕使用有機(jī)試劑。樣品直接溶解進(jìn)樣分 析。
[0033] (2)樣品檢測(cè)時(shí)間較短，對(duì)于產(chǎn)品中控或者清洗驗(yàn)證等能較快檢測(cè)結(jié)果，適用性良 好。
[0034] (3)檢測(cè)成本相比較于液質(zhì)聯(lián)用來說