一種水產(chǎn)品孔雀石綠的磁性分子印跡仿生elisa檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種較大范圍，具體是一種水產(chǎn)品孔雀石綠的磁性分子印跡仿生 ELISA檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 孔雀石綠（Malachite Green，MG)是一種三苯甲燒類物質(zhì)，又稱為鹽基塊綠、堿性 孔雀綠、孔雀綠、堿性綠、中國綠或苯胺綠，為具有金屬光澤的深綠色結(jié)晶狀固體?？兹甘G 曾經(jīng)在許多行業(yè)均有應(yīng)用，如皮革業(yè)、食品染色業(yè)、制陶業(yè)、印染業(yè)等。由于MG對(duì)于水生動(dòng) 物疾病的防疫和治療可以起到很好的療效，從1936年開始便廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中?？兹?石綠也可用作殺菌劑，對(duì)于防止霉菌在魚卵中生長以及真菌的二次污染有較好的效果。但 是，孔雀石綠存在高毒、高殘留和高致癌、誘變的缺點(diǎn)。我國在2002年5月已將其定為水產(chǎn) 生物違禁用藥，但由于其價(jià)格低廉，而且殺菌效果顯著，目前仍有不法商戶還在使用。由于 其添加量很少就可以達(dá)到很好的殺菌效果，給檢測(cè)水產(chǎn)品中的MG帶來一定的難度。因此， 建立MG殘留的檢測(cè)方法十分迫切并且具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 目前MG的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、以及氣相色 譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。這些方法在測(cè)定和分析水產(chǎn)品中孔雀石綠的殘留都具有結(jié)果可靠、靈敏 度高、選擇性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。但是這些方法在樣品前處理過程都存在繁瑣復(fù)雜、耗時(shí) 等不足，而且設(shè)備昂貴，檢測(cè)成本高；不僅需要消耗大量的溶劑和大量的時(shí)間，還容易造成 二次污染，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，發(fā)展一種快速高效的MG的檢測(cè)方法對(duì)控制水產(chǎn) 品質(zhì)量安全具有重要意義。
[0004] 分子印跡聚合物具有構(gòu)效預(yù)定性、特異識(shí)別性和廣泛適用性的顯著特點(diǎn)，而酶聯(lián) 免疫法檢測(cè)快速、靈敏。將二者結(jié)合起來，以合成的分子印跡聚合物作為仿生抗體，不僅具 有選擇特異性，而且可以重復(fù)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種水產(chǎn)品孔雀石綠的磁性分子印跡仿生ELISA檢測(cè)方 法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 一種水產(chǎn)品孔雀石綠的磁性分子印跡仿生ELISA檢測(cè)方法，具體步驟如下：
[0008] (I)Fe3O4的合成：稱取0· 30~0· 36g聚乙二醇，加入7~9mL超純水，超聲直至聚 乙二醇完全溶解，稱取2. 00~2. 06g FeCl3加入到聚乙二醇溶液中超聲溶解，再稱取1. 4~ I. 6g FeCl^入到上述溶液中至完全溶解，立即加入0. 4~0. 6mL0.1mol L η稀鹽酸，通氮 除氧12~18min，60°C水浴下邊攪拌邊迅速加入55~65mL氨水，調(diào)轉(zhuǎn)速至1500r mirf1，反 應(yīng)lh，用磁鐵進(jìn)行吸附，并用超純水洗脫4~6次，真空冷凍干燥后保存?zhèn)溆茫?br>[0009] (2)預(yù)聚合溶液的配制：將0· 08~0· 12g Fe3O4加入0· 8~I. 2mL油酸中并用玻 璃棒攪拌均勻，加入8~12mL 0. 05mol L-1MG氯仿溶液和43~170 μ L功能單體，在400r mirT1的轉(zhuǎn)速下攪拌25~35min，4°C下靜置I. 5~2. 5h形成A液；
[0010] (3)預(yù)乳化溶液的配制：將Span-80和tween-80各0· 4~0· 6mL加入22~28mL 超純水中，再加入475~950 μ L交聯(lián)劑，在400r mirT1下攪拌25~35min形成B液；
[0011] (4)MG磁性分子印跡聚合物的制備：在400r mirT1轉(zhuǎn)速攪拌下，將A液緩慢加入到 B液中，氮?dú)獬?8~22min，將溫度升到60°C，加入0. 08~I. 2g偶氮二異丁腈引發(fā)聚合 16~20h，反應(yīng)結(jié)束后用22~28mL甲醇破乳，抽濾后得到粗孔雀石綠磁性分子印跡聚合 物，產(chǎn)物用體積比為8~10:1的甲醇-乙酸混合液索氏提取至無孔雀石綠模板洗出，再用 甲醇洗至中性，最后用超純水洗去甲醇，真空冷凍干燥后備用；
[0012] (5)半抗原的合成：將850~950mg 4-甲?；郊姿?、2. 2~2. 6mL N，N-二甲基 苯胺和2. 2~2. 6g無水ZnCl2溶解在60mL無水乙醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流22~26h，室 溫冷卻后，加入28~32mL甲醇，滴加氨水至沉淀產(chǎn)生，過濾后用水沖洗，真空中用KOH進(jìn)行 干燥得到羧基化的隱性孔雀石綠；三氯甲烷溶解羧基化的隱性孔雀石綠，加入四氯對(duì)苯醌、 冰醋酸25°C下攪拌反應(yīng)1~2h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)等體積的三氯甲烷-四氯甲烷洗滌2~3次， 真空干燥可獲得半抗原羧基化孔雀石綠粉末；
[0013] (6)酶標(biāo)抗原的合成：將1. 8~2. 2mg半抗原羧基化孔雀石綠CMG粉末溶于0. 8~ 1. 2mL 20 % N，N-二甲基甲酰胺溶液，邊磁力攪拌邊加入1.8~2. 2mg mL-1 EDC 32~ 24 μ L，調(diào)pH 4. 5~5. 0,反應(yīng)18~22min后，迅速加入7. 0~8. Omg辣根過氧化物酶HRP， 調(diào)pH至7. 8~7. 2,室溫反應(yīng)2. 5~3. 5h得到CMG-HRP偶聯(lián)物，20 °C冷凍保存；
[0014] (7)檢測(cè)：取18~22mg磁性分子印跡聚合物置于IOmL離心管中，加入濃度為 0· 1~10000 μ gl/1的MG-PBS緩沖溶液2. 8~3. 2mL，然后立即加入稀釋度為I :1400~ 1600的酶標(biāo)抗原溶液2. 8~3. 2mL，不加 MG溶液的離心管為對(duì)照組，冰浴振蕩吸附1. 5~ 2. 5h ;棄上層溶液，每管加入140~160 μ L底物顯色液，顯色25~35min后每管加入45~ 55 μ L終止液，立即在酶標(biāo)儀上讀數(shù)，計(jì)算各個(gè)濃度下MG對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率。
[0015] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（2)中的功能單體為α -甲基丙烯酸、丙烯酰 胺或丙烯酸。
[0016] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（3)中的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、 二乙烯苯或三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
[0017] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（7)中的底物顯色液為鄰苯二胺。
[0018] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟（7)中的終止液為2mol Γ1的硫酸。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明磁性分子印跡聚合物具有特異識(shí) 別性和使固液快速分離的顯著特點(diǎn)，而酶聯(lián)免疫法檢測(cè)具有快速和靈敏的特點(diǎn)，將二者結(jié) 合起來，以合成的分子印跡聚合物作為仿生抗體，不僅具有選擇特異性，而且可以重復(fù)利 用。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明中磁性分子印跡聚合物電鏡掃描圖；
[0021] 圖2為本發(fā)明中磁性分子印跡聚合物傅里葉紅外光譜圖；
[0022] 圖3本發(fā)明中為磁性分子印跡聚合物磁滯回線；
[0023] 圖4和圖5為本發(fā)明中磁性分子印跡聚合物熱重圖；
[0024] 圖6為本發(fā)明中酶標(biāo)抗原紫外光譜圖；
[0025] 圖7為本發(fā)明中半抗原CMG紅外光譜圖；
[0026] 圖8為本發(fā)明中MG直接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0027] 圖9為ELISA和HPLC法對(duì)樣品中MG測(cè)定結(jié)果的一致性。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029] 本發(fā)明實(shí)施例
[0030] 一種水產(chǎn)品孔雀石綠的磁性分子印跡仿生ELISA檢測(cè)方法，具體步驟如下：
[0031] (I)Fe3O4的合成：稱取0. 33g聚乙二醇，加入8mL超純水，超聲直至聚乙二醇完全 溶解，稱取2. 03g FeCl3加入到聚乙二醇溶液中超聲溶解，再稱取I. 5gFeCl 2加入到上述溶 液中至完全溶解，立即加入〇.5mL 0.1mol Γ1稀鹽酸，通氮除氧15min，60°C水浴下邊攪拌 邊迅速加入60mL氨水，調(diào)轉(zhuǎn)速至1500r mirT1，反應(yīng)lh，用磁鐵進(jìn)行吸附，并用超純水洗脫5 次，真空冷凍干燥后保存?zhèn)溆茫?br>[0032] (2)預(yù)聚合溶液的配制：將0· Ig Fe3O4加入ImL油酸中并用玻璃棒攪拌均勾，加入 101111^0.051]1〇117 1]\^氯仿溶液和110以1^功能單體，在4001'111；[]^1的轉(zhuǎn)速下攪拌30111；[11，4°0 下靜置2h形成A液；
[0033] (3)預(yù)乳化溶液的配制：將Span-80和tween-80各0· 5mL加入25mL超純水中，再 加入700 μ L交聯(lián)劑，在400r mirT1下攪拌30min形成B液；
[0034] (4)MG磁性分子印跡聚合物的制備：在400r mirT1轉(zhuǎn)速攪拌下，將A液緩慢加入到 B液中，氮?dú)獬?0min，將溫度升到60°C，加入0.1 g偶氮二異丁腈引發(fā)聚合18h，反應(yīng)結(jié)束 后用25mL甲醇破乳，抽濾后得到粗孔雀石綠磁性分子印跡聚合物，產(chǎn)物用體積比為9:1的 甲醇-乙酸混合液索氏提取至無孔雀石綠模板洗出，再用甲醇洗至中性，最后用超純水洗 去甲醇，真空冷凍干燥后備用；
[0035] (5)半抗原的合成：將900mg 4-甲酰基苯甲酸、2. 4mL N, N-二甲基苯胺和2. 4g無 水