一種豆類(lèi)植物病原細(xì)菌的多重檢測(cè)方法及數(shù)據(jù)庫(kù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及豆類(lèi)細(xì)菌性病害檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種豆類(lèi)植物病原細(xì)菌的多重 檢測(cè)方法，及該檢測(cè)方法所采用的數(shù)據(jù)庫(kù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)中國(guó)海關(guān)總署數(shù)據(jù)顯示，2012年中國(guó)大豆進(jìn)口量為5838萬(wàn)噸，2013年進(jìn)口量 為6338萬(wàn)噸，2014年進(jìn)口量約為7070萬(wàn)噸，可見(jiàn)中國(guó)大豆對(duì)外依存度超過(guò)80 %。豆類(lèi) 上重要植物病原細(xì)菌主要有大豆細(xì)菌性疫?。≒seudomonas savastanoi pv.glycinea)、 大豆細(xì)菌性褐斑病（Pseudomonas syringae pv.syringae)、大豆斑疼病菌（Xanthomonas axonopodis pv. glycines)、菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌（Curtobacterium fIaccumfaciens pv. flaccumfaciens)、菜?暈疫病菌（Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola)、菜? 細(xì)菌性疫?。╔anthomonas axonopodis pv.phaseoli)和碗豆細(xì)菌性疫病菌（Pseudomonas syringae pv.pisi)。其中菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌、菜豆暈疫病菌和豌豆細(xì)菌性疫病菌是我國(guó) 進(jìn)境植物檢疫性有害生物。隨著豆類(lèi)進(jìn)口量的不斷增加，豆類(lèi)細(xì)菌性病害傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn) 也隨之加大。
[0003] 目前，植物病原細(xì)菌的傳統(tǒng)檢測(cè)鑒定檢測(cè)方法主要是依據(jù)分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)、生 理生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)等手段。但這些方法通常取決于病原細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝過(guò)程，一般需 要24-48小時(shí)，而且這些方法通常操作復(fù)雜，靈敏度比較低，不能滿(mǎn)足口岸植物檢疫的快速 通關(guān)要求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于核酸的基因序列分析、實(shí)時(shí)熒光PCR等各種檢 測(cè)技術(shù)成為植物細(xì)菌鑒定的首選方法，因其快速、靈敏度高等特點(diǎn)，使得植物細(xì)菌的快速檢 測(cè)和病害診斷成為現(xiàn)實(shí)；但存在檢測(cè)成本高，以及特異性探針引物的選擇困難復(fù)雜等問(wèn)題， 而且有時(shí)很難達(dá)到對(duì)細(xì)菌種、菌株水平的鑒定。因此，建立一種快速、靈敏、高通量的分析方 法用于檢測(cè)豆類(lèi)植物病原細(xì)菌具有重要的意義，也是我國(guó)口岸檢疫部門(mén)急需解決的問(wèn)題。
[0004] 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一 種用于微生物檢測(cè)方法，其基本原理是將微生物微量樣品與小分子基質(zhì)混合，在樣品盤(pán)上 形成共結(jié)晶，然后在脈沖激光作用下，基質(zhì)吸收激光能量躍迀到激發(fā)態(tài)，使樣品電離后從離 子源被傳送到質(zhì)量分析器內(nèi)測(cè)定其分子量。樣品的離子質(zhì)荷比（m/z)與離子在飛行管內(nèi)的 飛行速度成正比，不同m/z值的樣品離子到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間不同，從而得到不同m/z值的峰 圖。目前，MALDI-TOF MS技術(shù)以蛋白質(zhì)為革El標(biāo)分子已廣泛應(yīng)用于鑒定志賀氏菌（Shigella spp.)、沙門(mén)氏菌（Salmonella spp.)、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes)、大腸埃希 氏菌（Escherichia coli)等食源性致病細(xì)菌，由于該技術(shù)具有快速、操作簡(jiǎn)單、高通量以及 質(zhì)量范圍廣等特點(diǎn)，也逐漸被引入植物病原菌的鑒定研宄中。但是，目前尚沒(méi)有特別針對(duì)豆 類(lèi)細(xì)菌性病害的多重檢測(cè)方法及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本申請(qǐng)的目的是提供一種豆類(lèi)植物病原細(xì)菌的多重檢測(cè)方法及數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案：
[0007] 本申請(qǐng)公開(kāi)了一種豆類(lèi)植物病原細(xì)菌的多重檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟，（1) 在無(wú)菌條件下取受檢細(xì)菌l_2mg，用無(wú)菌水進(jìn)行至少一次洗滌后，離心棄上清，再用無(wú)菌 水：無(wú)水乙醇體積比為1:3的溶液洗滌至少一次，離心棄上清，然后加入濃度70%的甲酸和 /或濃度100%的乙腈，混勻，離心留取上清液，即受檢細(xì)菌蛋白液；（2)分別取1 μ L受檢細(xì) 菌蛋白液和1 μ L蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品點(diǎn)在質(zhì)譜靶芯片上，室溫晾干，再滴加1 μ L基質(zhì)溶液覆蓋在 受檢細(xì)菌蛋白液和蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品上，室溫晚干；每個(gè)受檢細(xì)菌蛋白液至少重復(fù)4個(gè)檢測(cè)點(diǎn)； (3)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)受檢細(xì)菌蛋白液進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn) 至少采集5張蛋白質(zhì)峰圖，將至少20張蛋白質(zhì)峰圖疊加制成受檢細(xì)菌質(zhì)譜圖；(4)將步驟 (3)獲得的受檢細(xì)菌質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果Log (score)多2. 5時(shí)，判斷 為陽(yáng)性；其中，數(shù)據(jù)庫(kù)為本申請(qǐng)構(gòu)建的包含豆類(lèi)上七種植物病原細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖 譜。
[0008] 需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的多重檢測(cè)方法，采用本申請(qǐng)?zhí)貏e針對(duì)豆類(lèi)上七種植物病 原細(xì)菌構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)對(duì)豆類(lèi)上七種重要的植物病原細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。 還需要說(shuō)明的是，上述質(zhì)荷比的值是一組相對(duì)穩(wěn)定的值，并且這些值是至少20張圖疊加后 出現(xiàn)概率為90%以上的數(shù)值，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在不同實(shí)驗(yàn)條件下，在這些數(shù)值的 基礎(chǔ)上進(jìn)行的小數(shù)點(diǎn)值的變化，或者說(shuō)在1%。允許誤差范圍內(nèi)個(gè)別值進(jìn)行的數(shù)值變化，也屬 于本申請(qǐng)的保護(hù)范圍。
[0009] 還需要說(shuō)明的是，其中Log(SC0re)是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì) 待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)分析后輸出的一個(gè)判別參數(shù)，而2. 5的數(shù)值是構(gòu)建檢測(cè)方法時(shí)，根據(jù)多 個(gè)陽(yáng)性樣品統(tǒng)計(jì)得出的，不同的數(shù)據(jù)庫(kù)該數(shù)值是不同的；也就是說(shuō)，在對(duì)待檢樣品進(jìn)行判斷 時(shí)，只有L 〇g(SC〇re)多2. 5,其檢測(cè)結(jié)果才具有意義，否則即便檢測(cè)結(jié)果與七個(gè)峰圖之一很 近似，也不能認(rèn)定為待檢樣品中含有峰圖對(duì)應(yīng)的病原細(xì)菌。
[0010] 優(yōu)選的，基質(zhì)溶液的溶劑為10%三氟乙酸：無(wú)菌去離子水：乙腈按體積比1:1:2 混合而成。
[0011] 優(yōu)選的，基質(zhì)溶液的溶質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸。
[0012] 本申請(qǐng)的另一面公開(kāi)了一種蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含豆類(lèi)上七種植 物病原細(xì)菌的七個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜，蛋白指紋圖譜分別由七種植物病原細(xì)菌的多個(gè)蛋 白質(zhì)的質(zhì)荷比及其蛋白質(zhì)波峰強(qiáng)度系數(shù)繪制而成；第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜為菜豆暈疫 病菌的特征峰圖，第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜為大豆細(xì)菌性疫病的特征峰圖，第三個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 蛋白質(zhì)指紋圖譜為大豆細(xì)菌性褐斑病的特征峰圖，第四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜為豌豆細(xì)菌 性疫病菌的特征峰圖，第五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜為菜豆細(xì)菌性疫病的特征峰圖，第六個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜為大豆斑瘆病菌的特征峰圖，七個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋圖譜為菜豆細(xì)菌性 萎蔫病菌的特征峰圖。
[0013] 需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的數(shù)據(jù)庫(kù)是采用豆類(lèi)上七種重要病原細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株為基 礎(chǔ)制備的，具有比較好的穩(wěn)定性和特異性，為豆類(lèi)上七種重要病原細(xì)菌的多重檢測(cè)奠定了 基礎(chǔ)。
[0014] 優(yōu)選的，數(shù)據(jù)庫(kù)適用于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。
[0015] 需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的數(shù)據(jù)庫(kù)是利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀構(gòu) 建的，因此，該數(shù)據(jù)庫(kù)可以很好的適用于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；但是，數(shù) 據(jù)庫(kù)與檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)，實(shí)際上是通過(guò)質(zhì)譜儀中的其中一個(gè)分析軟件實(shí)現(xiàn)的，也就是說(shuō)，在 這個(gè)分析軟件可以單獨(dú)使用的情況下，或者，有其他的分析軟件可以讀取并分析標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)指紋圖譜的情況下，本申請(qǐng)的數(shù)據(jù)庫(kù)也可以單獨(dú)用于其他分析軟件或設(shè)備。
[0016] 本申請(qǐng)的另一面還公開(kāi)了蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)在豆類(lèi)細(xì)菌性病害的檢測(cè)或鑒 定中的應(yīng)用。
[0017] 由于采用以上技術(shù)方案，本申請(qǐng)的有益效果在于：
[0018] 本申請(qǐng)的多重檢測(cè)方法，能夠同時(shí)檢測(cè)豆類(lèi)上的七種重要植物病原細(xì)菌，大大提 高了檢驗(yàn)檢疫速度；尤其是近年來(lái)豆類(lèi)作物及其產(chǎn)品進(jìn)口量日益增加的情況下，本申請(qǐng)的 多重檢測(cè)方法為口岸檢驗(yàn)檢疫等部門(mén)在豆類(lèi)細(xì)菌性病害檢測(cè)上提供了一種快速、靈敏、高 通量的分析檢測(cè)方法，可以縮短傳統(tǒng)檢測(cè)時(shí)間，加快我國(guó)口岸進(jìn)出口貨物的通關(guān)速度，降低 企業(yè)成本；同時(shí)這對(duì)于豆類(lèi)作物安全生產(chǎn)、種子引進(jìn)和外銷(xiāo)提供技術(shù)保障，提高進(jìn)境豆類(lèi)作 物及其產(chǎn)品疫情截獲率，提高防范外來(lái)有害生物入侵能力，都具有重要實(shí)用性和技術(shù)性。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是本申請(qǐng)實(shí)施例中菜豆暈疫病菌菌株470582的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行 時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)指紋圖譜；
[0020] 圖2是本申請(qǐng)實(shí)施例中大豆細(xì)菌性疫病菌株470513的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛 行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)指紋圖譜；
[0021] 圖3是本申請(qǐng)實(shí)施例中大豆細(xì)菌性褐斑病菌株470543的基質(zhì)輔助激光解吸電離 飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)指紋圖譜；
[0022] 圖4是本申請(qǐng)實(shí)施例中豌豆細(xì)菌性疫病菌菌株470575的基質(zhì)輔助激光解吸電離 飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)指紋圖譜；
[0023] 圖5是本申請(qǐng)實(shí)施例中菜豆細(xì)菌性疫病菌株470719的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛 行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)指紋圖譜；
[0024] 圖6是本申請(qǐng)實(shí)施例中大豆斑瘆病菌菌株470709的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行 時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)指紋圖譜；
[0025] 圖7是本申請(qǐng)實(shí)施例中菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌菌株470366的基質(zhì)輔助激光解吸電 離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本申請(qǐng)的關(guān)鍵在于對(duì)豆類(lèi)上的七種植物病原細(xì)菌進(jìn)行了系統(tǒng)的研宄，從而建立了 基于七種細(xì)菌性病害的特異性的蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的多重檢測(cè)方法，依據(jù)本申請(qǐng)構(gòu)建 的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以同時(shí)快速、簡(jiǎn)便地對(duì)豆類(lèi)上七種細(xì)菌性病害進(jìn)行判別，從而為縮短進(jìn)境豆類(lèi) 的通關(guān)時(shí)間提供技術(shù)支撐，為進(jìn)一步開(kāi)展植物病原細(xì)菌的檢疫鑒定，建立相關(guān)的檢測(cè)數(shù)據(jù) 庫(kù)提供科學(xué)依據(jù)。
[0027] 需要說(shuō)明的是，雖然本申請(qǐng)檢測(cè)的七種豆類(lèi)植物病原細(xì)菌目前都分別有不同的檢 測(cè)方法，如菌落形態(tài)、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)等，但是尚無(wú)同時(shí)對(duì)七種病原細(xì)菌進(jìn)行檢 測(cè)的多重檢測(cè)方法；本申請(qǐng)的技術(shù)方案正好填補(bǔ)了這樣一個(gè)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)上的空缺和需 求。
[0028] 下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例僅僅對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0029] 實(shí)施例
[0030] 一、材料
[0031] L供試菌株
[0032] 本例的供式菌株如表1所示。
[0033] 表1供式菌株情況
[0034]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豆類(lèi)植物病原細(xì)菌的多重檢測(cè)方法，其特征在于：包括以下步驟， (1) 在無(wú)菌條件下取受檢細(xì)菌l-2mg，用無(wú)菌水進(jìn)行至少一次洗滌后，離心棄上清，再 用無(wú)菌水：無(wú)水乙醇體積比為1:3的溶液洗滌至少一次，離心棄上清，然后加入濃度70%的 甲酸和/或濃度100%的乙腈，混勻，離心留取上清液，即受檢細(xì)菌蛋白液； (2) 分別取IyL受檢細(xì)菌蛋白液和IyL蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品點(diǎn)在質(zhì)譜靶芯片上，室溫晾干， 再滴加 I UL基質(zhì)溶液覆蓋在受檢細(xì)菌蛋白液和蛋白標(biāo)