使用基于uv光的dna成像細(xì)胞術(shù)來檢測和/或診斷癌癥的體外方法
【專利說明】使用基于UV光的DNA成像細(xì)胞術(shù)來檢測和/或診斷癌癥的體外方法
[0001]本申請是2007年5月14日提交的題為“使用基于UV光的DNA成像細(xì)胞術(shù)來檢測和/或診斷癌癥的體外方法”的中國專利申請200780024364.1的分案申請。
[0002]發(fā)明主題
[0003]本發(fā)明涉及通過測量細(xì)胞核核酸的UV吸收在體外確定人或動物細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞核核酸的量的方法。
[0004]本發(fā)明還涉及基于細(xì)胞核核酸的UV吸收的體外檢測生物樣品中的癌細(xì)胞的方法。
[0005]本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于細(xì)胞核核酸的UV吸收的診斷和/或預(yù)測人或動物對象體內(nèi)癌癥的體外方法。
[0006]發(fā)明背景
[0007]癌癥的早期檢測是治療癌癥患者的關(guān)鍵因素。有各種在生物樣品中檢測癌細(xì)胞，并從而診斷已存在的癌癥或至少估計(jì)未來癌癥發(fā)展的可能性的可能的選擇。這些不同的方法包括癌組織的物理檢驗(yàn)、癌細(xì)胞的形態(tài)特征檢測、細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如膜和細(xì)胞核的免疫組化染色及特征鑒定、測量腫瘤特異因子的表達(dá)等等。
[0008]檢測癌細(xì)胞的一種可能的選擇是所謂的DNA細(xì)胞術(shù)(DNA cytometry)，其測量細(xì)胞核DNA的量以檢測與正常DNA含量的偏離。假設(shè)如果一個(gè)細(xì)胞(作為突變事件的后果)含有比已知標(biāo)準(zhǔn)(已知為非癌性的，即“健康的”或“正常的”類型)更少或更多的DNAJP么DNA含量上的這種偏離可以提示重要的染色體重排及正在進(jìn)行的癌癥發(fā)展。
[0009]因此在癌癥診斷范圍，在科研和臨床應(yīng)用中，通過核酸特異性染色對細(xì)胞核DNA進(jìn)行量化正在越來越多地進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用中。
[0010]通過流式或成像細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞核DNA含量進(jìn)行測量特別基于如下假設(shè):(i)結(jié)合至DNA的染料的量正比于存在的DNA的量，和(ii)從染料通過發(fā)射、吸收或透射產(chǎn)生的光信號正比于染料的量。
[0011]典型地用于通過DNA成像細(xì)胞術(shù)(DNA image cytometry)測量細(xì)胞核DNA的一種DNA特異性染色方法是一種基于酸的反應(yīng)，根據(jù)Feulgen和Rossenbeck命名，通常簡單地稱為福爾根反應(yīng)(Feulgen react1n)。事實(shí)上所述福爾根反應(yīng)是一種生色反應(yīng)，其中DNA被酸水解產(chǎn)生具有游離醛基的不含嘌呤的DNA(即所謂脫嘌呤核酸(apurinic acid, APA))。這些物質(zhì)之后與含有共價(jià)結(jié)合至所述游離醛基的染料的希夫試劑(schiff’s reagent)反應(yīng)。
[0012]雖然所述福爾根反應(yīng)對于DNA具有特異性，但是其具有多種缺點(diǎn)。其非常耗費(fèi)時(shí)間，并且是一種復(fù)雜精細(xì)的反應(yīng)，需要非常小心地控制并驗(yàn)證以獲得可重復(fù)的和有意義的結(jié)果。普遍用于移除嘌呤堿基的HCl將APA水解為較小片段導(dǎo)致一個(gè)問題。APA分子的片段化導(dǎo)致這些片段從細(xì)胞核中移除并因此導(dǎo)致丟失可染色的DNA物質(zhì)。
[0013]因此，本領(lǐng)域中已經(jīng)進(jìn)行了嘗試以基于形態(tài)特征鑒定、免疫組化染色和DNA染色的組合可靠地檢測癌細(xì)胞并診斷癌癥。
[0014]US 2004/0197839 Al公開了同時(shí)使用兩種不同類型的染色以鑒別癌細(xì)胞，其中一種染色例如檢測形態(tài)特征，而第二種(免疫學(xué))染色例如測量一種腫瘤特異性標(biāo)記的表達(dá)。
[0015]但是，仍然需要給出測量細(xì)胞核DNA的量并檢測癌細(xì)胞和癌癥的可靠、迅速及有效的途徑的方法。
[0016]發(fā)明目的和簡述
[0017]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于確定細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)的核酸的量的方法。這些核酸可以是雙鏈的，例如DNA。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測待測生物樣品中癌細(xì)胞的存在的方法。
[0019]本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的目的是提供使得能夠診斷人或動物對象體內(nèi)癌癥的存在和/或癌癥可能發(fā)生的方法。
[0020]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，提供了獨(dú)立權(quán)利要求中限定的方法。本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案特別在從屬權(quán)利要求中限定。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了體外確定至少一個(gè)生物樣品中存在的至少一個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞核核酸例如細(xì)胞核DNA的量的方法，其中所述方法包括如下步驟:
[0022]a)體外確定所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸，
[0023]b)體外確定a)中確定的細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收。
[0024]在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，所述細(xì)胞核的位置和/或尺寸可以通過使用UV光和/或相差顯微術(shù)在所述至少一個(gè)細(xì)胞中(粗略)確定。如果在步驟a)中使用UV光，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光。特別優(yōu)選的是波長例如為大約250nm、255nm 或 260nmo
[0025]在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光用于在步驟b)中測量UV吸收。特別優(yōu)選的是波長例如為大約250nm、255nm或260nm。
[0026]在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將所述至少一個(gè)細(xì)胞與至少一種能夠與所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的雙鏈核酸相互作用的熒光標(biāo)記接觸，并從而通過步驟b)中的UV吸收確定結(jié)合至細(xì)胞核雙鏈核酸的所述至少一種熒光標(biāo)記的細(xì)胞核信號強(qiáng)度。為此目的，可以使用例如波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光。
[0027]然而，在本發(fā)明其他示例性實(shí)施方案中，不需要使所述細(xì)胞中的細(xì)胞核核酸例如DNA通過例如免疫組化染色、化學(xué)反應(yīng)例如福爾根反應(yīng)或熒光標(biāo)記顯色。
[0028]因此，本發(fā)明的方法包括實(shí)現(xiàn)確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸并確定所述細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收的基本概念的各種實(shí)施方案。為了確定細(xì)胞核位置和/或尺寸(等同于確定細(xì)胞核的邊界)，可以使用利用可見光的相差顯微術(shù)以及利用UV光的檢測方法。為了確定細(xì)胞核的UV吸收，可以僅依賴于UV測量而不加入能夠與雙鏈核酸相互作用的熒光標(biāo)記，或者可以使用這些標(biāo)記。
[0029]因此，理論上可以用相差顯微術(shù)對細(xì)胞核進(jìn)行定位并確定所述細(xì)胞核的UV吸收而不使用上文描述的標(biāo)記，也可以用相差顯微術(shù)對細(xì)胞核進(jìn)行定位并使用上文描述的標(biāo)記確定所述細(xì)胞核的UV吸收，可以使用UV吸收測量以對細(xì)胞核進(jìn)行定位并測量細(xì)胞核UV吸收而不使用上文描述的標(biāo)記，以及可以使用UV吸收測量以對細(xì)胞核進(jìn)行定位并使用上文描述的標(biāo)記測量細(xì)胞核UV吸收，等等。
[0030]在兩個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用相差顯微術(shù)對細(xì)胞核進(jìn)行定位并使用上文描述的標(biāo)記確定UV吸收，或涉及使用UV吸收測量以對細(xì)胞核進(jìn)行定位并測量細(xì)胞核UV吸收而不使用上文描述的標(biāo)記。這兩個(gè)實(shí)施方案將在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地了解，如果在這兩個(gè)實(shí)施方案的范圍內(nèi)討論某些方面例如優(yōu)選的波長、標(biāo)記的性質(zhì)、使用的檢測裝置等等，那么這些解釋等同地適用于如上文所述的本發(fā)明的其他實(shí)施方案，除非其另外明確地指出。術(shù)語例如“細(xì)胞”、“癌細(xì)胞”、“樣品”、“非整倍性(aneuploidity) ”等等的定義在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案中當(dāng)然具有同樣的含義，除非另外指出。本發(fā)明設(shè)想的各種方法也可以用于同樣目的。
[0031]在本發(fā)明一個(gè)示例性實(shí)施方案中，前述用于確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核核酸例如DNA的量的方法可以用于體外檢測至少一個(gè)生物樣品內(nèi)的至少一個(gè)癌細(xì)胞。
[0032]在上述方法的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞核UV吸收(也可以稱為細(xì)胞核信號強(qiáng)度)也可以用于計(jì)算細(xì)胞的(非整)倍性((aneu)ploidity)狀態(tài)。
[0033]這可以通過將獲得的細(xì)胞核UV吸收與在與已知為非癌類型并且細(xì)胞核DNA含量已知的細(xì)胞在基本上相仿或相同條件下獲得的細(xì)胞核UV吸收對比實(shí)現(xiàn)。
[0034]在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，偏離2或4至少10%的非整倍性狀態(tài)被認(rèn)為提示癌細(xì)胞。
[0035]在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，如上述確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核核酸例如DNA的量的方法用于檢測至少一個(gè)生物樣品中的至少一個(gè)癌細(xì)胞，所述癌細(xì)胞與選自包括白血病、淋巴瘤、腦癌、腦脊液癌(cerebrospinal cancer)、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和黑素瘤的一組的癌癥相關(guān)。
[0036]在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，如上述確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核核酸例如DNA的量的方法在生物樣品的至少一個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行，其中所述生物樣品選自包括骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、粘膜樣品、周圍血樣品、腦脊液樣品、尿樣品、滲出物樣品、細(xì)針抽取物、周圍血碎肩、皮膚碎肩、石蠟包埋組織和冷凍切片的一組。
[0037]在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測生物樣品中具有上文描述的特征的癌細(xì)胞的方法使用能夠檢測、測量和計(jì)算UV吸收信號及任選地相差信號的顯微鏡。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用共聚焦激光掃描顯微鏡。
[0038]在所有上述方法中，可以依賴于具有預(yù)先確定的單一波長的(UV)光檢測細(xì)胞核并測量細(xì)胞核UV吸收。
[0039]在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了診斷和/或預(yù)測人或動物對象體內(nèi)癌癥的體外方法，所述方法包括如下步驟:
[0040]a)提供得自所述對象的生物樣品；
[0041]b)體外確定所述樣品的至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸；
[0042]c)體外測量在a)中確定的細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收；
[0043]d)從步驟d)中獲得的細(xì)胞核信號強(qiáng)度計(jì)算所述至少一個(gè)細(xì)胞的倍性狀態(tài)，和
[0044]e)基于所述倍性狀態(tài)確定癌癥的存在和/或可能未來發(fā)生癌癥。
[0045]本發(fā)明的診斷方法也包括實(shí)現(xiàn)確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸并確定所述細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收的基本概念的各種實(shí)施方案。為了確定細(xì)胞核位置和/或尺寸(等同于確定細(xì)胞核的邊界)，仍舊可以使用利用可見光的相差顯微術(shù)以及利用UV光的檢測方法。為了確定細(xì)胞核的UV吸收，可以僅依賴于UV測量而不加入能夠與雙鏈核酸相互作用的熒光標(biāo)記，或者可以使用這些標(biāo)記。
[0046]雖然診斷方法仍舊將主要針對兩個(gè)示例性實(shí)施方案描述，即用相差顯微術(shù)對細(xì)胞核進(jìn)行定位并使用上文描述的標(biāo)記確定細(xì)胞核的UV吸收，或使用UV吸收測量以對細(xì)胞核進(jìn)行定位并測量細(xì)胞核UV吸收而不使用上文描述的標(biāo)記，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，如果在這兩個(gè)實(shí)施方案的范圍內(nèi)討論某些方面例如優(yōu)選的波長、標(biāo)記的性質(zhì)、使用的檢測裝置等等，那么這些解釋等同地如上文所述應(yīng)用于本發(fā)明的其他實(shí)施方案，除非其另外明確地指出。術(shù)語例如“細(xì)胞”、“癌細(xì)胞”、“樣品”、“非整倍性(aneuploidity) ”等等的定義在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案中當(dāng)然具有同樣的含義，除非另外指出。
[0047]當(dāng)然，上文描述的各個(gè)方面例如使用某些波長或某些類型的顯微鏡等等，等同地應(yīng)用于診斷范圍。
[0048]因此，在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，細(xì)胞核的位置和/或尺寸可以通過使用UV光和/或相差顯微術(shù)在所述至少一個(gè)細(xì)胞中(粗略)確定。如果在步驟b)中使用UV光，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光。特別優(yōu)選的是波長例如為大約250nm、255nm 或 260nmo
[0049]在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟b)中細(xì)胞核在所述至少一個(gè)細(xì)胞中的位置和/或尺寸僅通過相差顯微術(shù)確定。
[0050]在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，在步驟c)中使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光測量UV吸收。特別優(yōu)選的是波長例如為大約250nm、255nm或260nm。
[0051]在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟c)中可以將所述至少一個(gè)細(xì)胞與至少一種能夠與所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的雙鏈核酸相互作用的熒光標(biāo)記接觸，并從而確定結(jié)合至雙鏈核酸的所述至少一種熒光標(biāo)記的細(xì)胞核信號強(qiáng)度。為此目的，可以使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光。
[0052]在診斷方法的另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，不需要使所述細(xì)胞中的細(xì)胞核核酸例如DNA通過例如免疫組化染色、化學(xué)反應(yīng)例如福爾根反應(yīng)或熒光標(biāo)記顯色。
[0053]如果使用熒光標(biāo)記，那么可以將上文和下文描述的同樣類型的標(biāo)記與細(xì)胞接觸。
[0054]本發(fā)明這一方面的另外一個(gè)實(shí)施方案涉及診斷和/或預(yù)測人或動物對象體內(nèi)的癌癥的體外方法，所述方法包括上述特征，并且其中偏離2n或4η(η是染色體數(shù)目)至少10%的倍性狀態(tài)提示癌細(xì)胞，并因此提示癌癥的存在或(未來)可能發(fā)生的癌癥。
[0055]當(dāng)然，對于本發(fā)明這些關(guān)于診斷方法的方面，所述生物樣品可以選自與上文描述的相同的樣品。
[0056]因此，用上文描述的診斷方法診斷的和/或預(yù)測的癌癥可以選自與上文描述的相同的一組癌癥。
[0057]在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷和/或預(yù)測人或動物對象體內(nèi)的癌癥的方法使用能夠檢測UV吸收信號、熒光信號并且可任選地用于相差目的的顯微鏡。為了確定細(xì)胞核的位置和/或尺寸以及細(xì)胞核UV吸收，可以優(yōu)選地使用共聚焦激光掃描顯微鏡。
【附圖說明】
[0058]圖1示出了一幅直方圖，即當(dāng)確定了一群非癌細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量后典型地獲得的光密度模式。所述細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)。
[0059]圖2示出了一幅直方圖，即當(dāng)確定了一群癌細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量后典型地獲得的光密度模式。相應(yīng)于值為4的峰提示正在進(jìn)行的癌癥發(fā)展，因?yàn)楸粰z查的細(xì)胞類型在其正常狀態(tài)是非增殖的。
[0060]圖3示出了在眼中(左圖)和口中(右圖)的刷拭活檢的實(shí)施例。
[0061]圖4示出了在大約230nm和300nm波長范圍之間DNA和蛋白質(zhì)的不同吸收行為。
[0062]圖5示出了本發(fā)明使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光確定細(xì)胞核的邊界的一個(gè)實(shí)施方案的原則的示意圖。
[0063]圖6示出了粘膜細(xì)胞的熒光測量，所述細(xì)胞已經(jīng)用EtBr染色。細(xì)胞核清晰可見，但是細(xì)胞其他部分也顯示一些焚光。
[0064]圖7示出了粘膜細(xì)胞的相差圖像(左圖)、熒光圖像(中間圖)和組合圖像(右圖)，所述細(xì)胞已經(jīng)用EtBr染色。將所述相差顯微術(shù)圖像與熒光圖像合并并相關(guān)使得可以精確地確定細(xì)胞核位置及其尺寸。
[0065]發(fā)明詳述
[0066]通