唐氏綜合征圖譜模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種獲取作為中間結(jié)果的唐氏綜合征信息，特別是涉及一種唐氏綜合 征圖譜模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 唐氏綜合征（DownSyndrome，DS)，是由常染色體異常引起的遺傳病。該病患者往 往具有3條21號染色體，而正常只有兩條。該病具有較高的發(fā)病率，患者主要特征為嚴(yán)重 的先天性智力低下智力障礙、具有特殊的面容、體格發(fā)育遲緩，和特殊面容，并常伴有先天 性心臟病、免疫力低下等80多種疾病。相對于正常人，DS患者罹患白血病的幾率也大大增 加，由于患者大多數(shù)不能料理自己的生活，而且基本不能勞動，因此給家庭和社會造成沉重 的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每例唐氏綜合征患兒會給家庭帶來大約39. 00萬元人民幣的經(jīng)濟(jì)負(fù) 擔(dān)，而給社會造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)則高達(dá)45. 00萬元人民幣左右。目前我國大約有60萬唐氏綜 合征患者。在國外，唐氏綜合征的發(fā)病數(shù)量占所有染色體異常疾病的91. 6%。
[0003] 唐氏綜合征是最為常見的染色體數(shù)目異常的非整倍體遺傳病，出生干預(yù)是目前預(yù) 防該病的有效措施。目前，干預(yù)DS患者的出生的主要方式是進(jìn)行產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷。但 是傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查漏檢率和假陽性較高。因此，為了提高DS胎兒的檢出率，降低侵入式產(chǎn) 前診斷帶來的風(fēng)險(xiǎn)性，研宄者們致力于探索通過母血胎兒有核細(xì)胞，母血胎兒游離DNA和 母血胎兒游離RNA等途徑，建立新的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷方法。
[0004] 胎兒有核細(xì)胞中的基因組包括了胎兒所有的遺傳信息，因此最初的無創(chuàng)產(chǎn)前診 斷主要集中于孕婦循環(huán)血中完整胎兒有核細(xì)胞的研宄。因胎兒有核紅細(xì)胞表面具有特異性 標(biāo)記，不易增殖，且半衰期短，因而被認(rèn)為是最適合的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的胎兒細(xì)胞類型。對母 血胎兒有核紅細(xì)胞的分析主要包括細(xì)胞富集，鑒別和針對性檢測（如PCR，F(xiàn)ISH等）。但由 于母血中胎兒細(xì)胞數(shù)量過少，每毫升母血中往往不到1個(gè)，制約了這一途徑的發(fā)展。
[0005] 胎兒游離的DNA片段存在于母體外周的循環(huán)血中，由于胎兒游離的DNA在孕婦血 漿中的含量大，大概占孕婦血漿總DNA含量的3%~6%，比胎兒細(xì)胞占母血總細(xì)胞的比例 要大的多，因此胎兒游離DNA在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用開始備受關(guān)注。最早將母體外周循 環(huán)血中胎兒游離DNA用于產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的研宄發(fā)現(xiàn)，在懷孕時(shí)間基本相近時(shí)，孕DS 孕婦血漿中胎兒游離DNA大約為孕正常胎兒孕婦1到2倍。但因?yàn)橛写罅磕冈从坞xDNA存 在，相對而言胎兒游離DNA含量較低，因而需采用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化或者甲醛等方法富集母體 外周循環(huán)血中的胎兒游離DNA，但是這些富集方法存在一定的缺陷，使得胎兒游離DNA的檢 測的存在著非常大的困難，其付出的成本與效益之間的比值也還有待于考察。
[0006]胎兒游離RNA的來源與胎兒游離DNA相同，并且是以蛋白-RNA復(fù)合物的形式存在 于血漿中，因此穩(wěn)定性較好。利用胎兒游離RNA進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷比胎兒游離DNA具有優(yōu) 勢，主要表現(xiàn)在：孕婦血漿中胎兒游離RNA的絕對含量高，分析難度降低；孕婦血漿中mRNA 完全來自胎盤組織，沒有了母體游離RNA的干擾。
[0007] 目前，利用母血胎兒游離RNA進(jìn)行產(chǎn)前篩查唐氏綜合征的方法主要基于RNA-SNP 的比例關(guān)系。從理論上看，唐氏綜合征的3條21號染色體中有2條來源于父親（母親），剩 下的1條則來源于母親（父親）。21號染色體相關(guān)基因的雜合SNP位點(diǎn)上不同的核苷酸在 正常細(xì)胞中的比例是1 : 1，但是在唐氏綜合征患者中的比例是2 : 1或1 : 2。假設(shè)基因 的轉(zhuǎn)錄效率是相同的，那么在血漿中mRNA-SNP的比例關(guān)系與DNA-SNP的比例是一致的。采 用數(shù)字PCR和質(zhì)譜兩種技術(shù)對孕婦血漿中PLAC4基因的mRNA-SNP比例關(guān)系進(jìn)行測定，可以 取得96. 5%的臨床特異性和90%的臨床靈敏度。然而基于質(zhì)譜和數(shù)字PCR技術(shù)的母血胎 兒游離RNA檢測方法，步驟繁瑣、成本較高，因而直到目前都沒有得到廣泛的應(yīng)用。
[0008] 綜上所述，基于傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的缺陷，以及已有無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法 的不足，使得探索新的無創(chuàng)性唐氏綜合征胎兒產(chǎn)前診斷標(biāo)志物具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 基于此，有必要針對上述問題，提供一種唐氏綜合征圖譜模型的構(gòu)建方法。
[0010] 一種唐氏綜合征圖譜模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0011] 獲取已經(jīng)脫離人體的孕婦外周血，離心，吸取血漿，并將所述血漿置于零下60°c~ 零下100°C的環(huán)境中保存；
[0012] 提取所述血漿的蛋白質(zhì)，得到待測液；
[0013] 測定所述待測液的蛋白質(zhì)含量；
[0014] 將所述待測液進(jìn)行免疫印跡檢測；
[0015] 統(tǒng)計(jì)分析所述免疫印跡檢測結(jié)果，建立所述唐氏綜合征圖譜模型。
[0016] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述提取所述血漿的蛋白質(zhì)包括以下步驟：將所述血漿與 雙蒸水按體積比為1:1混合，搖勻后得到混合液，并將所述混合液與5XSDS-PAGE上樣緩沖 液按體積比4 :1混合，煮沸l(wèi)Omin，緩慢恢復(fù)至室溫后，置于零下20°C環(huán)境中保存。
[0017] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述孕婦外周血的體積為2~4mL。
[0018] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述孕婦外周血的體積為3mL。
[0019] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述離心的溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為10000~150000轉(zhuǎn)/分鐘， 尚心時(shí)間為10~20分鐘。
[0020] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述血漿置于零下80°C的環(huán)境中保存。
[0021] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，采用BCA法測定所述待測液的蛋白質(zhì)含量。
[0022] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，測定所述待測液的蛋白質(zhì)含量，包括以下步驟：
[0023] 配制不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0024] 將待測液進(jìn)行稀釋；
[0025] 配制BCA工作液；
[0026] 將BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液及已稀釋的待測液分別加入至96孔板中，再加入BCA工作液，在 溫度為37°C，避光的條件下，孵育30分鐘；
[0027] 用酶標(biāo)儀測定波長為560nm時(shí)的吸光度值；
[0028] 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得出待測液中蛋白質(zhì)的濃度。
[0029] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述免疫印跡檢測具體包括如下步驟：電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一 抗孵育、二抗孵育及顯色。
[0030] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述唐氏綜合征圖譜模型包括ApolipoproteinE，Serum amyloidP-component，ComplementfactorB，2-oxoglutaratedehydrogenase-like，mitochondrial，Nucleosomeassemblyprotein1-likel〇
[0031] 上述唐氏綜合征圖譜模型的構(gòu)建方法，利用母血血漿中蛋白質(zhì)的差異性表達(dá)，為 產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷唐氏綜合征提供作為中間結(jié)果的唐氏綜合征圖譜模型信息，具有較高 的特異性和敏感性，且這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)有助于闡明疾病的發(fā)病機(jī)理，及為唐氏胎兒 的早期診斷提供部分輔助依據(jù)。
【附圖說明】
[0032] 圖1為本發(fā)明一實(shí)施例的唐氏綜合征圖譜模型的構(gòu)建方法示意圖；
[0033] 圖2為本發(fā)明一實(shí)施例的蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0034] 圖3為本發(fā)明一實(shí)施例的孕唐氏綜合征孕婦外周血血漿蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測 圖；
[0035] 圖4為本發(fā)明一實(shí)施例的孕正常胎兒孕婦外周血血漿蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測圖；
[0036] 圖5為本發(fā)明一實(shí)施例的血漿中蛋白質(zhì)在DS組及NC組中差異性表達(dá)的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明 的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā) 明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不 違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
[0038] 本發(fā)明提供一種唐氏綜合征圖譜模型的構(gòu)建方法，包括：獲取已經(jīng)脫離人體的孕 婦外周血，離心，吸取血漿，并將所述血漿置于零下60°C~零下100°C的環(huán)境中保存；提取 所述血漿的蛋白質(zhì)，得到待測液；測定所述待測液的蛋白質(zhì)含量；將所述待測液進(jìn)行免疫 印跡檢測；統(tǒng)計(jì)分析所述免疫印跡檢測結(jié)果，建立所述唐氏綜合征圖譜模型