用熒光監(jiān)測(cè)溫度的制作方法
【專利說明】用熒光監(jiān)測(cè)溫度
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年10月9日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/711，631的優(yōu)先權(quán) 和權(quán)益，該申請(qǐng)整體通過引用合并于本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 聚合酶鏈反應(yīng)（"PCR"）是分子生物學(xué)中廣泛使用的技術(shù)。它們的名稱源自關(guān)鍵 組分之一，即通過酶促?gòu)?fù)制擴(kuò)增DNA鏈的DNA聚合酶。通常，PCR使用耐熱的聚合酶、脫氧 核苷三磷酸（"(1階？")、一對(duì)引物和模板0嫩。單個(gè)？〇?反應(yīng)（或循環(huán)）通常包括（1)提高 樣本的溫度至足以將雙鏈DNA分子熔解或變性成單鏈模板的溫度，（2)冷卻樣本，讓DNA引 物結(jié)合或退火到每條模板，以及任選地（3)重新調(diào)節(jié)樣本溫度，以優(yōu)化向每條被結(jié)合引物 的末端酶促添加dNTP，形成新的DNA分子。隨著PCR進(jìn)行，產(chǎn)生的DNA("擴(kuò)增子"）自身用 作模板用于進(jìn)一步的復(fù)制。這啟動(dòng)了 DNA模板以指數(shù)擴(kuò)增的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。使用PCR，可能在多 個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)擴(kuò)增單拷貝的DNA或較少拷貝的DNA，產(chǎn)生數(shù)百萬或更多的DNA拷貝。
[0004] 有效的PCR依賴于在熱循環(huán)中準(zhǔn)確且可重復(fù)地獲得產(chǎn)物/模板的變性（或熔解） 溫度和引物退火溫度。這反過來依賴于準(zhǔn)確測(cè)量和控制樣本和/或溶液的溫度。PCR樣本 溫度的測(cè)量和控制可手動(dòng)進(jìn)行或通過自動(dòng)化儀器，例如熱循環(huán)儀（或溫度循環(huán)器）進(jìn)行。許 多熱循環(huán)儀中的溫度傳感器測(cè)量含有擴(kuò)增溶液的PCR管周圍的金屬模塊或隔室的溫度。使 用這種"外部"溫度傳感器，有時(shí)可在溫度保持恒定的平衡過程中獲得準(zhǔn)確的測(cè)量。然而， 在溫度轉(zhuǎn)變過程中，溶液的溫度經(jīng)常滯后于儀器模塊或隔室的溫度，可能導(dǎo)致對(duì)溫度監(jiān)控 和控制的不準(zhǔn)確和不一致 該影響在PCR循環(huán)速度提尚時(shí)變得更明顯。
[0005] PCR溶液內(nèi)的直接傳感器接觸雖然可能比外部溫度測(cè)量更準(zhǔn)確，但也存在問題。這 種PCR的直接、內(nèi)部測(cè)定由于產(chǎn)物污染、PCR抑制、傳感器熱質(zhì)增加以及光學(xué)測(cè)量的障礙而 通常不被贊成。這些擔(dān)憂中的許多隨著樣本體積減小而愈發(fā)嚴(yán)峻。然而，在較大的樣本中， 直接的物理傳感器僅測(cè)量一個(gè)位置的溫度，而這可能不能準(zhǔn)確地反映整個(gè)溶液的溫度。
[0006] 隨著時(shí)間，PCR的溫度循環(huán)變得更快。在更快的速度時(shí)，大部分循環(huán)時(shí)間花費(fèi)在溫 度轉(zhuǎn)變中，并且溶液溫度很少追隨所測(cè)量的儀器溫度。改善對(duì)快速PCR循環(huán)中溶液溫度的 測(cè)定的嘗試包括依賴于樣本體積的預(yù)測(cè)算法，以及具有與樣本相同的熱響應(yīng)使得它們?cè)趧?dòng) 力學(xué)上相匹配的傳感器。然而，由于PCR中的生化反應(yīng)快速，并且有許多迅速改變樣本（尤 其是小樣本）溫度的方式，限制PCR-致性（特別是在快速時(shí)）的因素似乎是準(zhǔn)確的溫度 測(cè)量。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明包括使用發(fā)光（luminescence)監(jiān)測(cè)樣本的內(nèi)部狀態(tài)。本文描述的本發(fā)明 的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式包括使用條件敏感性試劑的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)在發(fā)光特性準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè) 樣本的狀況。某些實(shí)施方式包括，例如使用pH敏感性試劑和/或溫度敏感性試劑的內(nèi)在發(fā) 光在PCR熱循環(huán)和/或準(zhǔn)確度提高的儀器校準(zhǔn)過程中監(jiān)測(cè)樣本溫度的方法和系統(tǒng)。在至少 一個(gè)實(shí)施方式中，溫度敏感試劑的內(nèi)在熒光作為溫度的函數(shù)以已知和/或可預(yù)測(cè)的方式而 變化。因此，某些實(shí)施方式包括使用樣本熒光作為內(nèi)部溫度的監(jiān)測(cè)物，以反映整個(gè)樣本的平 均溫度或控制熱循環(huán)。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方式中，描述了包含至少一種條件敏感性試劑的PCR混合物。所述PCR 混合物可包含進(jìn)行PCR所需要的一種或多種試劑（例如，至少一個(gè)核酸模板、包括經(jīng)設(shè)計(jì)退 火到所述至少一個(gè)模板核酸的至少一部分上的至少一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物的多個(gè) 核酸引物、熱穩(wěn)定性聚合酶、dNTP等）以及條件敏感性試劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述條件 敏感性試劑可包括至少一種能響應(yīng)于刺激而發(fā)出依賴于溫度的發(fā)光信號(hào)的溫度敏感性試 劑。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種溫度敏感性試劑發(fā)出的發(fā)光信號(hào)具有在95°C和 50°C之間改變至少50%的熒光信號(hào)。例如，所述至少一種溫度敏感性試劑可顯示約1% /°C 的溫度敏感度。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，由所述溫度敏感性試劑發(fā)出的發(fā)光信號(hào)的量不與 樣本中存在的核酸的量成正比。例如，優(yōu)選所述溫度敏感性試劑不是結(jié)合dsDNA的染料，所 述溫度敏感性試劑的發(fā)光信號(hào)不受dsDNA變性（或熔解）的影響，并且/或者所述溫度敏 感性試劑未結(jié)合至核酸。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，描述了測(cè)量樣本溫度的方法。所述方法可包括（1)提供待 測(cè)量的樣本，所述樣本包含已知量的響應(yīng)于刺激而發(fā)出發(fā)光信號(hào)的溫度敏感性試劑，其中， 所述溫度敏感性試劑發(fā)出的發(fā)光信號(hào)的量作為溫度的函數(shù)以已知且可預(yù)測(cè)的方式而變化。 所述方法進(jìn)一步包括（2)測(cè)量所述溫度敏感性試劑發(fā)出的發(fā)光信號(hào)的量；以及（3)確定作 為所述溫度敏感性試劑發(fā)出的發(fā)光信號(hào)的函數(shù)的樣本溫度。
[0011] 在某些實(shí)施方式中，可通過觀察已知量的溫度敏感性試劑發(fā)出的發(fā)光信號(hào)的量直 接測(cè)量樣本溫度。在其它實(shí)施方式中，可通過以下確定樣本溫度：(a)觀察在第一溫度來自 溫度敏感性試劑的發(fā)光信號(hào)的量，（b)觀察在第二溫度來自溫度敏感性試劑的發(fā)光信號(hào)的 量和（c)確定第一溫度和第二溫度之間的發(fā)光信號(hào)之比。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，描述了校準(zhǔn)樣本加熱裝置的方法。所述方法可包括（1)提 供包括上述溫度敏感性試劑的校準(zhǔn)樣本。所述方法可進(jìn)一步包括（2)測(cè)量所述樣本的裝置 確定的溫度，（3)刺激所述溫度敏感性試劑以引起從其發(fā)出發(fā)光信號(hào)，（4)測(cè)量從所述溫度 敏感性試劑發(fā)出的發(fā)光量，和/或（5)作為所述溫度敏感性試劑發(fā)出的發(fā)光信號(hào)的函數(shù)，測(cè) 量校準(zhǔn)樣本的發(fā)光確定的溫度。所述方法還包括（6)調(diào)節(jié)所述裝置確定的溫度，以反映所 述發(fā)光確定的溫度。示例性地，所述溫度敏感性試劑為熒光染料。
[0013] 另一些其它實(shí)施方式包括PCR系統(tǒng)，所述PCR系統(tǒng)經(jīng)設(shè)置以使用依賴于溫度的發(fā) 光作為內(nèi)部樣本溫度的指示。所述系統(tǒng)可包括（1)經(jīng)設(shè)置以接受樣本的樣本容器，（2)經(jīng) 設(shè)置以控制樣本溫度的樣本溫度控制裝置，和/或（3)經(jīng)設(shè)置以使用樣本溫度控制裝置來 調(diào)節(jié)樣本溫度的樣本溫度控制機(jī)件。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，樣本溫度控制機(jī)件包括樣本 溫度升高機(jī)件和樣本溫度降低機(jī)件。所述系統(tǒng)還可包括（4)經(jīng)設(shè)置以量化樣本發(fā)出的溫度 敏感性發(fā)光的量的樣本發(fā)光測(cè)量元件。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣本溫度控制機(jī)件基 于樣本發(fā)光調(diào)節(jié)樣本的溫度。
[0014] 因此，在一個(gè)示例的實(shí)施方式中，提供了測(cè)量樣本溫度的方法，所述方法包括提供 包含溫度敏感性試劑的樣本，所述溫度敏感性試劑響應(yīng)于刺激而發(fā)出光信號(hào)；其中，所述溫 度敏感性試劑發(fā)出的光信號(hào)的量以已知的方式作為溫度的函數(shù)而變化；測(cè)量所述溫度敏感 性試劑發(fā)出的光信號(hào)的量；并確定作為溫度敏感性試劑發(fā)出的光信號(hào)的函數(shù)的樣本溫度。 在具體的實(shí)施方式中，所述溫度敏感性試劑包括熒光染料，并且所發(fā)出的光信號(hào)包括熒光。 在其它具體的實(shí)施例中，所述熒光染料包括磺酰羅丹明B，并且所述樣本包括PCR混合物。
[0015]在其它示例性實(shí)施方式中，提供了校準(zhǔn)樣本加熱裝置的方法，所述方法包括提供 包含溫度敏感性試劑的樣本，所述溫度敏感性試劑響應(yīng)于刺激而發(fā)出光信號(hào)；其中，所述溫 度敏感性試劑發(fā)出的光信號(hào)以已知且可預(yù)測(cè)的方式作為溫度的函數(shù)而變化，刺激所述溫度 敏感性試劑以引起從其發(fā)出光信號(hào)；基于溫度敏感性試劑發(fā)出的光信號(hào)，確定所述樣本的 發(fā)光確定的溫度；確定所述樣本的裝置確定的溫度；以及基于所述發(fā)光確定的溫度和所述 裝置確定的溫度中至少之一，調(diào)節(jié)所述樣本加熱裝置的溫度設(shè)置。
[0016]在另一些其它實(shí)施方式中，提供了熱循環(huán)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)經(jīng)配置以使用溫度依賴 性發(fā)光作為平均內(nèi)部樣本溫度的指示，所述系統(tǒng)包括經(jīng)配置接收樣本的樣本容器；經(jīng)配置 控制樣本溫度的樣本溫度控制裝置；經(jīng)配置使用所述樣本溫度控制裝置調(diào)節(jié)所述樣本的溫 度的樣本溫度控制機(jī)件（mechanism);其中，所述樣本溫度控制機(jī)件包括樣本溫度升高機(jī) 件和樣本溫度降低機(jī)件；以及經(jīng)配置量化所述樣本發(fā)出的溫度敏感發(fā)光的量的樣本發(fā)光測(cè) 量元件；其中，所述樣本溫度控制機(jī)件基于樣本發(fā)光調(diào)節(jié)所述樣本的溫度。
[0017]在另一些其它示例性實(shí)施方式中，提供了 PCR混合物，所述PCR混合物包含響應(yīng)于 刺激而發(fā)出光信號(hào)的溫度敏感性試劑；其中，所述溫度敏感性試劑發(fā)出的光信號(hào)的量不與 樣本中存在的核酸的量成正比；并且其中，所述溫度敏感性試劑發(fā)出在95°C和50°C之間變 化的焚光信號(hào)。
[0018]在額外的示例性實(shí)施方式中，提供了 PCR試劑盒，所述PCR試劑盒包含溫度敏感性 試劑，所述溫度敏感性試劑響應(yīng)于刺激而發(fā)出光信號(hào)；以及使用所述溫度敏感性試劑確定 樣本的溫度的可理解的說明書。
[0019]在更多示例性實(shí)施方式中，提供了使用反饋控制而控制樣本的熱循環(huán)譜的方法， 所述方法包括在第一溫度提供樣本，其中，所述樣本包括響應(yīng)于刺激而發(fā)出光信號(hào)的條件 敏感性試劑；刺激所述條件敏感性試劑，以引起從其發(fā)出光信號(hào)；以及檢測(cè)所述條件敏感 性試劑發(fā)出的光信號(hào)；其中，所述發(fā)光信號(hào)的預(yù)定值表示用以啟動(dòng)向熱循環(huán)譜中的下一階 段改變的合適的時(shí)間。
[0020] 在其它更多的示例性實(shí)施方式中，提供了熱循環(huán)裝置，所述熱循環(huán)裝置經(jīng)配置使 用反饋溫度控制執(zhí)行樣本的熱循環(huán)譜，所述熱循環(huán)裝置包括：樣本容器，所述樣本容器經(jīng)配 置接收具有至少一種溫度敏感性試劑的樣本，所述溫度敏感性試劑響應(yīng)于刺激而發(fā)出光信 號(hào)，其中，所述溫度敏感性試劑包括被動(dòng)參考試劑（passive reference reagent);樣本溫 度控制組件，所述樣本溫度控制組件經(jīng)配置調(diào)節(jié)樣本的溫度并響應(yīng)于觸發(fā)事件而啟動(dòng)向熱 循環(huán)譜中下一階段改變，其中，所述觸發(fā)事件包括檢測(cè)所述發(fā)光信號(hào)的預(yù)定值。
[0021] 本發(fā)明的實(shí)施方式的另外的特征和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中說明或者可通過實(shí)施 此類實(shí)施方式而被獲悉?？赏ㄟ^所附權(quán)利要求書中具體指出的儀器或組合的方式實(shí)現(xiàn)和獲 得這些實(shí)施方式的特征和優(yōu)點(diǎn)。這些特征和其它特征在下面的描述和所附權(quán)利要求書中將 整體上更顯而易見，或者可通過如下文所示實(shí)施此類實(shí)施方式而被獲悉。
【附圖說明】
[0022] 為了描述可獲得本發(fā)明的上述和其它優(yōu)點(diǎn)和特征的方式，將通過參考附圖中描述 的【具體實(shí)施方式】，對(duì)以上簡(jiǎn)要描述的發(fā)明作更具體的說明。應(yīng)該理解這些附圖僅描述了本 發(fā)明典型的實(shí)施方式并因此不會(huì)認(rèn)為是對(duì)其范圍的限制，將通過使用附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更 具體和詳細(xì)地描述和解釋，其中：
[0023] 圖1描述了根據(jù)公開的方面的熱循環(huán)系統(tǒng)的示例性實(shí)施方式的框圖。
[0024]圖2描述了用于熱循環(huán)系統(tǒng)的基于熒光的溫度控制的示意圖。
[0025] 圖3描述了保持在45°C (x線）、55°C (實(shí)線）、65°C (點(diǎn)劃線）、75°C (虛線）、 85°C (點(diǎn)線）和95°C (三角線）時(shí)在530nm激發(fā)的磺酰羅丹明B(單鈉鹽）的溫度敏感譜。
[0026] 圖4描述了在490nm激發(fā)的磺酰羅丹明B (單鈉鹽）的溫度敏感性和不敏感性，光 譜數(shù)據(jù)顯示為在波長(zhǎng)范圍內(nèi)的比（在45°C的發(fā)射強(qiáng)度（e. i.)/在95°C的發(fā)射強(qiáng)度（e. i.)) 的對(duì)數(shù)值。
[0027] 圖5A~5C顯示了使用基于焚光的循環(huán)控制擴(kuò)增的3種指定（forensic)的單核 苷酸多態(tài)性rs763869(圖5A)、rs876724(圖5B)和rs917118(圖5C)的熔解導(dǎo)數(shù)圖。
[0028] 圖6A~6B描述了利用基于熒光的溫度控制使用保持時(shí)間為"0"秒的擴(kuò)增。圖6A 描述了實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，而圖6B描述了使用背景去除的量子方法分析的負(fù)導(dǎo)數(shù)熔解曲線。 [0029]圖7描述了沒有（實(shí)線）以及具有（虛線）油覆蓋層時(shí)在LighiCycler? 480上 加熱和冷卻過程中的熒光。
[0030]圖8描述了LightCycler? 480上加熱過程中的熒光。
[0031] 圖9A~9C描述了在3個(gè)不同的儀器上于94°C (圖9A)、80°C (圖9B)和50°C (圖 9C)評(píng)估的磺酰羅丹明B的儀器平衡和熱降解。
[0032]圖10A~10C描述 了磺酰羅丹明 B 在80°C 于LightCycler? 1.5 (圖10A)、 LightCycler? 2.0(圖 10B)和LightCycler? 480(圖 ioc)上的熒光淬滅。
[0033] 圖11A描述了在9個(gè)實(shí)時(shí)PCR儀器上關(guān)聯(lián)溫度與熒光的校準(zhǔn)曲線。儀器包括類別 I (短劃線）、類別II (實(shí)線）、類別III (點(diǎn)線）和類別IV(點(diǎn)劃線）。
[0034] 圖11B描述了LighiCycler夂1.5的圖5A中描述的數(shù)據(jù)的線性圖的斜率（y = 1890X+0. 013, R2 = 0? 999)。
[0035] 圖12描述了通過熒光（"溶液"-實(shí)線）、微熱電偶（"熱電偶"-短劃線）確定 的，以及通過儀器（"儀器"-點(diǎn)線）顯示的LightCycl