篩選分子群的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種篩選分子群的方法。更具體說來，本發(fā)明涉及一種篩選分子群的 方法，所述分子對某些令人感興趣的標(biāo)記具有高選擇性。
【背景技術(shù)】
[0002] 所有的生物反應(yīng)都需要分子間的相互作用?？贵w與抗原間以及配體與受體間的相 互作用對于因外在刺激而起始一連串的路徑十分關(guān)鍵。辨識相互作用中所涉及的特異分子 對于研宄及制藥發(fā)展非常重要。
[0003] 舉例來說，在人類基因組計劃完成后，大多數(shù)人類表達(dá)基因已得到辨識。然而，在 新興的蛋白質(zhì)組學(xué)紀(jì)元中，蛋白質(zhì)在這些所揭露的基因中起重要作用。為了可有效地破解 這些蛋白質(zhì)的謎團(tuán)，已做了許多努力以產(chǎn)生針對人類基因組中的每一種人類表達(dá)基因的至 少一種抗體?？贵w因其固有的敏感性及特異性，而成為研宄其一對一關(guān)系的標(biāo)靶蛋白質(zhì)時 最多功能的工具。然而，錯綜復(fù)雜的其中一個原因在于，當(dāng)放置于不同的細(xì)胞（如癌細(xì)胞） 中時，這些蛋白質(zhì)并非永遠(yuǎn)以相同的方式表達(dá)。許多蛋白質(zhì)已知在不同的細(xì)胞環(huán)境中具有 易位能力，因此，其對應(yīng)的抗體在給定的細(xì)胞中可辨識獨(dú)特的位置。此外，在許多情況下，蛋 白質(zhì)易位與癌細(xì)胞的活化相關(guān)。在未來，檢測這些活動可能幫助診斷癌癥的類型與階段。在 細(xì)胞膜上直接篩選抗原的高通量方法可能發(fā)現(xiàn)潛在的治療標(biāo)靶以及新的疾病標(biāo)記。
[0004] 然而，即使已生成了許多有用的抗體，仍有兩方面的主要限制，即（1)如何在給定 的細(xì)胞中直接發(fā)現(xiàn)特異性抗原（如膜或表面標(biāo)記），及（2)如何快速地識別可識別這些抗原 的有用的抗體。
[0005] 以膜結(jié)合蛋白為例，許多膜結(jié)合蛋白與特定的疾病狀態(tài)（如肺癌）相關(guān)聯(lián)，且 常成為引人注意的治療標(biāo)靶。膜結(jié)合蛋白的系統(tǒng)性與定量分析可增進(jìn)我們了解其在不 同的疾病狀態(tài)中，調(diào)控生物程序所扮演的角色。在最常被定序的基因組中，估計約有20 到30%的開放閱讀框架編碼完整的膜結(jié)合蛋白（布朗德J. (Blonder，J.)等人，富集完 整膜蛋白以使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析（Enrichment of integral membrane proteins for proteomic analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry).蛋白質(zhì)組學(xué)研宄雜志（Journal ofProteome Research)，2002. 1(4): 第351-360頁；韓D. K. (Han，D. K.)等人，使用同位素編碼的親和標(biāo)簽和質(zhì)譜法對分化誘導(dǎo) 的微粒體蛋白進(jìn)行定量圖譜化（Quantitative profiling of differentiation-induced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry). 自然生物技術(shù)（Nature Biotechnology)，2001. 19(10):第946-951頁）。然而，由于少量的 膜結(jié)合蛋白，膜結(jié)合蛋白質(zhì)組尚未被圖譜化且仍具實驗挑戰(zhàn)性。此外，利用高通量的蛋白質(zhì) 組學(xué)以及以基因芯片為基礎(chǔ)的篩選研宄，所辨識出的新穎標(biāo)靶常常缺乏抗體來確立其位置 及功能，進(jìn)一步阻礙了研宄者研宄潛在的膜結(jié)合蛋白。直接表達(dá)分析方法來識別抗體及辨 識受體（表面標(biāo)記或膜結(jié)合蛋白）為必要的。
[0006] 因生理條件的不同，造成隨機(jī)篩選很耗時且常常不可行。使用單獨(dú)抗體來篩選新 的受體也不可能，因為其必須要有超過25000種抗體來適用整個基因組。此外，癌細(xì)胞常常 具有多種過度表達(dá)的受體且同樣的標(biāo)靶蛋白在不同的細(xì)胞類型可能有不同的位置布置。因 此，有必要開發(fā)一種快速且有效的方法，在同一時間中解決這些問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種小群體表達(dá)篩選以篩選對令人感興趣的特定生物標(biāo)記具高度 選擇性的分子群。
[0008] 本發(fā)明提供了一種篩選分子群的方法，包含檢測所述分子群是否對介質(zhì)具有結(jié)合 特異性。
[0009] 本發(fā)明另外提供一種篩選細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞上的生物標(biāo)記群的方法，其包含上述的方 法，其中所述分子群為所述生物標(biāo)記群。
[0010] 本發(fā)明另外提供一種組合物，其包含由上述方法所篩選出的一群分子。
[0011] 本發(fā)明另外提供一種遞送治療劑的方法，包含投與上述組合物至細(xì)胞或個體。
[0012] 本發(fā)明另外提供一種診斷個體狀態(tài)的方法，其包含提供生物樣本；使上述組合物 與所述生物樣本接觸；和辨識所述組合物是否與所述生物樣本結(jié)合，其中所述結(jié)合的存在 意指所述個體患有所述狀態(tài)。
[0013] 本發(fā)明將在以下段落中詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)可由以下實施 方式和權(quán)利要求書顯而易見。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :脂質(zhì)體/PEI/PEG復(fù)合物（LPPC)吸附抗體-標(biāo)祀癌細(xì)胞的示意圖?？贵w與 DiO-標(biāo)記的LPPC混合，接著以PEG1500阻斷。PEG-阻斷LPPC/抗體復(fù)合物是與細(xì)胞培育 (如A549)，且接著以FACScan流式細(xì)胞儀分析以測定其結(jié)合至細(xì)胞表面的效能。每個樣本 的熒光平均值以陽性對照組（細(xì)胞上有100% DiO-標(biāo)記LPPC)及陰性對照組（未結(jié)合抗 體）標(biāo)準(zhǔn)化。每個樣本的熒光平均值先除以陽性對照組的熒光平均值，接著，所述標(biāo)準(zhǔn)化的 值再除以陰性對照組的熒光平均值。
[0015] 圖2 :以抗體為基礎(chǔ)的脂質(zhì)體用于藥物篩選的示意圖?？傆?50種抗體分為50個 群，以用于形成脂質(zhì)體/抗體（LPPC/抗體）復(fù)合物。為了篩選抗體結(jié)合至細(xì)胞表面的效 能，50個LPPC/抗體復(fù)合物在4°C下與不同的癌細(xì)胞系培育。與細(xì)胞表面具有高結(jié)合效能 的LPPC/抗體復(fù)合物優(yōu)先以FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。自選定群（如3A群）中的單 獨(dú)抗體，接著LPPC培育并繼以FACScan分析，以測定其結(jié)合至細(xì)胞表面的效能。免疫熒光 法則做為二級篩選以確定選定標(biāo)祀的亞細(xì)胞（subcellular)定位。
[0016] 圖3:脂質(zhì)體-調(diào)節(jié)抗體群的篩選以辨識不同癌細(xì)胞系內(nèi)特異性受體。50個單獨(dú)抗 體群與DiO-標(biāo)記LPPC混合，接著以三種不同細(xì)胞系（A549、HT29和MCF7)培育并以FACScan 流式細(xì)胞儀分析。5個群（26、21、3八、38和￥1(：群）相較于其它抗體群展現(xiàn)了優(yōu)選的結(jié)合效 能。這些群再次分為單獨(dú)抗體以測試它們對LPPC的結(jié)合效能，如圖4到7所示。所述"細(xì) 胞"意指未受DiO染色的單獨(dú)細(xì)胞，"NC Ab"意指LPPC上的未結(jié)合抗體。
[0017] 圖4 :確認(rèn)在3B群中優(yōu)先蛋白的亞細(xì)胞定位。（A)使用LPPC/抗體復(fù)合物系統(tǒng)，以 三種不同的癌細(xì)胞測試3B群中的單獨(dú)抗體。這些所選擇的抗體中有許多經(jīng)進(jìn)一步以免疫 熒光法確認(rèn)其亞細(xì)胞定位。（B) 3B-4 (MAPK8,紅色）位于HT29細(xì)胞（結(jié)腸癌細(xì)胞）的細(xì)胞 膜上，但在A549細(xì)胞（肺癌細(xì)胞）中并無。
[0018] 圖5 :確認(rèn)在2G群中優(yōu)先蛋白的亞細(xì)胞定位。（A)使用LPPC/抗體復(fù)合物系統(tǒng)，以 三種不同的癌細(xì)胞測試2G群中的單獨(dú)抗體。這些所選擇的抗體中有許多經(jīng)進(jìn)一步以免疫 熒光法確認(rèn)其亞細(xì)胞定位。（B) 2G-4 (NU98,紅色）位于A549細(xì)胞的細(xì)胞膜上，2G-7 (MAG1A9， 紅色）位于A549和HT29細(xì)胞的細(xì)胞膜上。
[0019] 圖6 :確認(rèn)在21群中優(yōu)先蛋白的亞細(xì)胞定位。（A)使用LPPC/抗體復(fù)合物系統(tǒng)，以 三種不同的癌細(xì)胞測試21群中的單獨(dú)抗體。這些所選擇的抗體中的兩個（21-3及21-6) 進(jìn)一步以免疫熒光法確認(rèn)其亞細(xì)胞定位。（B) 21-3 (PIK3R4,紅色）和（C)2I-6 (NPR2,紅色） 位于MCF7細(xì)胞的細(xì)胞膜上。
[0020] 圖7 :確認(rèn)在Y1C群中優(yōu)先蛋白的亞細(xì)胞定位。（A)使用LPPC/抗體復(fù)合物系統(tǒng)， 以六種不同的癌細(xì)胞測試Y1C群中的單獨(dú)抗體。這些所選擇的抗體中有許多經(jīng)進(jìn)一步以免 疫熒光法確認(rèn)其亞細(xì)胞定位。（B)Y1C-4(SPAG5,紅色）位于Mahlavu (肝細(xì)胞癌細(xì)胞）和 MCF7 (乳腺癌細(xì)胞系）的細(xì)胞膜上，但在A549細(xì)胞（肺癌細(xì)胞系）、肝細(xì)胞和Huh7 (肝細(xì)胞 癌細(xì)胞）中并無。（C) Y1C-5 (P0LR2A，紅色）位于A549細(xì)胞的細(xì)胞膜上。
【具體實施方式】
[0021] 本發(fā)明提供了一種篩選分子群的方法，所述方法包含檢測所述分子群是否對介質(zhì) 具有結(jié)合特異性。
[0022] 本文中術(shù)語"分子"意指一種涉及生物化學(xué)反應(yīng)的小分子或大分子。優(yōu)選地，所述 分子為大分子，如蛋白質(zhì)、肽、核酸、寡核苷酸或多核苷酸。所述分子可為天然或人造分子。 另一方面，所述分子可經(jīng)純化或與其它成分混合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述分子 在正常狀態(tài)和非正常狀態(tài)（如疾?。┫掠胁煌谋磉_(dá)型態(tài)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中， 所述分子在不同的細(xì)胞型態(tài)下有不同的表達(dá)型態(tài)。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，所述分 子為抗體、抗原、酶、底物、配體、受體、膜結(jié)合蛋白或細(xì)胞表面標(biāo)記。在本發(fā)明的其它優(yōu)選實 施例中，所述分子為抗體。
[0023] 本發(fā)明中術(shù)語"分子群"意指分子的群組，其中所述分子可為相同或不同的。
[0024] 本發(fā)明中術(shù)語"介質(zhì)"意指一種涉及生物化學(xué)反應(yīng)的小分子或大分子。優(yōu)選地，所 述介質(zhì)為大分子，如蛋白質(zhì)、肽、核酸、寡核苷酸或多核苷酸。所述介質(zhì)可為天然或人造介 質(zhì)。另一方面，所述介質(zhì)可經(jīng)純化或與其它成分混合。優(yōu)選地，所述介質(zhì)位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞 上。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述分子在正常狀態(tài)和非正常狀態(tài)（如疾?。┫掠胁?同的表達(dá)型態(tài)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，所述分子在