一種微陣列生物芯片及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微陣列生物芯片及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 研宄小分子藥物與蛋白靶標(biāo)的相互作用，對基礎(chǔ)科學(xué)研宄和藥物開發(fā)具有重要意 義。但在實(shí)際應(yīng)用中，存在一種藥物針對多靶標(biāo)相互作用的情況，如對藥物雜泛性和副作用 的研宄、先導(dǎo)化合物的優(yōu)化以及舊藥新用等。因此，開發(fā)一種高效的小分子-靶標(biāo)相互作用 檢測方法將對靶標(biāo)活性評價(jià)及藥物篩選等具有推動作用。
[0003] 在分子生物學(xué)層面，藥物開發(fā)往往需要對先導(dǎo)化合物/藥物與蛋白靶標(biāo)之間的相 互作用信息（如動力學(xué)和親和力）進(jìn)行采集和評價(jià)。近年來，表面等離子共振生物傳感器 (surfaceplasmonresonance，SPR)以免標(biāo)記、高靈敏和實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)勢，迅速發(fā)展成為研 宄小分子與蛋白靶標(biāo)相互作用動力學(xué)和親和力的重要工具。目前，SPR檢測技術(shù)主要為基 于角度檢測的方法（以BIAcore系列產(chǎn)品為主），該方法將蛋白固定在芯片表面，流通小分 子藥物，對光學(xué)信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。然而，隨著檢測樣品的多樣性以其相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜 性，要求檢測手段具有高通量和高效率的特征，這種傳統(tǒng)的"一對一"的檢測方法已經(jīng)無法 滿足應(yīng)用需求。
[0004] 表面等離子共振成像技術(shù)（SPRimaging，SPRi)的出現(xiàn)很好地解決了以上的通量 問題。SPRi技術(shù)采用微陣列格式和平行光檢測，可以一次性地獲得芯片表面在檢測區(qū)域內(nèi) 的相互作用信息，具有"一對多"甚至"多對多"的高通量檢測優(yōu)勢。利用SPRi技術(shù)，研宄 者們開發(fā)出了高通量檢測蛋白-蛋白、多肽-多肽以及DNA-DNA相互作用的方法。然而，對 于小分子在蛋白陣列上的檢測，依舊存在著挑戰(zhàn)：①由于當(dāng)前基于強(qiáng)度檢測的SPRi技術(shù)的 靈敏度低于角度檢測技術(shù)，加之小分子檢測時(shí)，由于其分子量低產(chǎn)生信號響應(yīng)本身很小，使 得高通量SPRi儀器的檢測能力較低；②SPRi的數(shù)據(jù)質(zhì)量與采集面積有關(guān)，通量越高會導(dǎo)致 樣品點(diǎn)面積減小，噪音增加，使得檢出困難；③當(dāng)前SPRi芯片表面多采用硫醇修飾，蛋白固 定量較低，使得與之相互作用的小分子藥物也較少，信號自然很難檢出。
[0005] 針對以上問題，研宄者們主要針對儀器改良和芯片化學(xué)修飾兩個(gè)方面增強(qiáng)SPRi 的檢測靈敏度，以獲得在蛋白微陣列上檢測小分子的能力。例如，N.J.Tao等利用SPRi和 電化學(xué)阻抗結(jié)合，提高了SPRi的檢測靈敏度，成功在P38激酶陣列上檢測到SB203580小 分子的結(jié)合，并獲得了動力學(xué)和親和力常數(shù)（Anal.Chem. 2014, 86, 9860-9865);但該方 法只是適用于該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的儀器，在SPRi主流儀器上沒有通用性。另外，在芯片化學(xué)修 飾方面，Y.M.Wang等人在SPRi芯片表面構(gòu)建了三維的聚丙烯酸（PAA)高分子刷，并采 用微接觸印刷調(diào)控高分子間的空間距離，獲得較高的蛋白固定量（App1iedSurfaceScien ce266 (201) 313-318) ;H.W.Ma等利用表面引發(fā)聚合的方法在SPR芯片表面構(gòu)建了三維高分 子表面，并獲得優(yōu)化的抗原-抗體檢測信號（Chem.Commun.，2011，47,1190-1192)。但是，以 上針對芯片化學(xué)修飾的方法均未在蛋白陣列上成功檢測小分子藥物。因此，開發(fā)出在SPRi 儀器上高通量檢測小分子-蛋白相互作用的方法具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用于表面等離子共振系統(tǒng)的微陣列生物芯片及其 制備方法、利用其制備的蛋白微陣列以及利用所述蛋白微陣列進(jìn)行檢測的方法和在小分子 藥物檢測方面的應(yīng)用。
[0007] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)路線：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供一種微陣列生物芯片，包括玻璃芯片基底和修飾層，所述修 飾層包括依次疊加在所述玻璃芯片基底表面的鉻層、銀和/或金層、自組裝單分子層、光交 聯(lián)劑和高分子層。
[0009] 表面等離子共振成像技術(shù)是利用光波與金屬（金和/或銀）中自由電子波產(chǎn)生的 共振，通過檢測共振信號來確定金屬表面生物分子相互作用情況（結(jié)合或解離），因此金和 /或銀在表面是必要條件。在玻璃芯片基底與金和/或銀之間鍍一層鉻是由于金和/或銀 與玻璃芯片基底的粘附性不好，鉻起到粘附緩沖層作用。
[0010] 另外，芯片的修飾方法大致可以分為兩類：物理層（玻璃-鉻-金和/或銀），主 要作用是激發(fā)表面等離子激元共振；化學(xué)層（自組裝單分子層-光交聯(lián)劑-高分子），其主 要用于生物分子的固定和對金屬基底的保護(hù)。其中，物理層為SPRi傳感芯片的常規(guī)技術(shù)手 段；而化學(xué)層是本發(fā)明的重點(diǎn)，經(jīng)過本發(fā)明的方法修飾的芯片，可以有效提高生物分子在生 物芯片表面的固定量，使原來很難檢測到的小分子藥物能夠檢測出來。
[0011] 在本發(fā)明中，小分子藥物檢測的實(shí)現(xiàn)主要通過提高蛋白分子固定量，而蛋白分子 固定量主要依靠三維高分子表面的修飾，自組裝單分子層用于保護(hù)基底和提供末端活性基 團(tuán)，光交聯(lián)劑起到橋連單分子層和高分子的作用。
[0012] 優(yōu)選地，所述絡(luò)層的厚度為0?l_9nm，例如可以是0?lnm、lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、 6nm、7nm、8nm或9nm，優(yōu)選為3nm。對于絡(luò)層的厚度，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)金屬與玻璃的 粘附性進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。如果粘附性良好，也可以不加鉻層；但現(xiàn)有的技術(shù)中，二者的粘附 性一般還未達(dá)到可以省去鉻層的程度；因此，鉻層不宜太薄，以保證成膜，增加粘附性；如 果鉻層厚度太大，則不利于光波的傳導(dǎo)。
[0013] 優(yōu)選地，所述銀和/或金層的厚度為40_60nm，例如可以是40nm、41nm、42nm、43nm、 44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、 59nm或60nm，優(yōu)選為47_50nm。如果厚度超過此范圍（大于60nm或小于40nm)，會導(dǎo)致靈 敏度下降，影響對于小分子藥物檢測的靈敏度。
[0014] 優(yōu)選地，所述自組裝單分子層的試劑為末端功能化的硫醇。
[0015] 優(yōu)選地，所述末端功能化的硫醇為單硫醇和/或雙硫醇。
[0016] 優(yōu)選地，所述末端功能化的硫醇為烷硫醇和/或帶有PEG嵌段的硫醇。
[0017] 優(yōu)選地，所述末端功能化的基團(tuán)為羥基、羧基、氨基、醛基、環(huán)氧基或甲氧基。
[0018] 硫醇的通式為：HS-R1_R2 ;
[0019] 其中，R1為烷烴鏈，R2 -般為末端功能化的PEG鏈。例如，硫醇在金表面自組裝主 要依靠Au-S鍵以及R1之間的范德華力，以形成致密單層膜；R2為生物相容性分子，主要用 于抗非特異性吸附，降低背景信號。硫醇的末端功能化基團(tuán)主要用于進(jìn)一步的化學(xué)修飾，如 連接光交聯(lián)劑等，不同末端基團(tuán)可以有不同的化學(xué)修飾方法，但反應(yīng)原理都是基本的化學(xué) 共價(jià)結(jié)合。
[0020] 優(yōu)選地，所述光交聯(lián)劑為含有光敏感基團(tuán)，在特定波長（能量）光照下可以進(jìn)行 化學(xué)反應(yīng)的試劑，優(yōu)選為吖丙因、重氮、乙酰苯、二苯甲酮或蒽醌類中的任意一種或者至少 兩種的混合物，例如可以是吖丙因，重氮，乙酰苯和二苯甲酮的混合物，或吖丙因、乙酰苯、 二苯甲酮和蒽醌類的混合物。光敏感基團(tuán)，即光交聯(lián)基團(tuán)，為在光照下會產(chǎn)生反應(yīng)的化學(xué)基 團(tuán)。本發(fā)明主要利用光化學(xué)反應(yīng)活化光敏感基團(tuán)，使其快速、非選擇性且共價(jià)地將高分子結(jié) 合在其表面。
[0021] 優(yōu)選地，所述高分子指具有生物相容性且具有活性端基的功能高分子，包括但不 限于具有良好抗非特異性結(jié)合性能的合成高分子，例如可以是聚乙二醇及其衍生物、含氟 聚合物、聚丙烯酸及其衍生物、聚甲基丙烯酸及其衍生物、聚苯乙烯、聚乳酸、兩性甜菜堿類 聚合物等；還可以是具有良好生物相容性的天然高分子，如硝化纖維、殼聚糖或葡聚糖及其 衍生物等。
[0022] 第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的微陣列生物芯片的制備方法，包括以下 步驟：
[0023] (1)在玻璃芯片基底鍍上鉻層，再在鉻層的表面鍍上銀和/或金層；
[0024] (2)完成步驟（1)后清洗芯片，在表面形成自組裝單分子層；
[0025] (3)將光交聯(lián)劑共價(jià)結(jié)合于自組裝單分子層的表面；
[0026] (4)將高分子溶液旋涂在完成步驟（3)的芯片表面；
[0027] (5)待步驟（4)所述高分子溶液的溶劑揮發(fā)后，用紫外光照射使所述高分子接枝 在芯片表面；
[0028] 任選地，進(jìn)行步驟（6):
[0029] (6)將接枝在芯片表面的高分子進(jìn)行功能化。
[0030] 優(yōu)選地，步驟（1)所述鍍上鉻層及銀和/或金層的方法為金屬熱蒸和/或離子濺 射；采用以上方法形成的鍍層顆粒較小且厚度均勻，有利于成像傳感的應(yīng)用。
[0031] 其中，步驟（2)所述清洗的方式為溶劑清洗、超聲清洗以及等離子體清洗方法中 的任意一種或至少兩種的組合，例如可以是溶劑清洗，超聲清洗，等離子清洗和超聲清洗的 組合，或溶劑清洗、超聲清洗和等離子清洗的組合。所述溶劑清洗所用溶劑為去離子水、乙 醇、丙酮或N，N-二甲基甲酰胺中的任意一種或至少兩種的混合，例如可以是去離子水，乙 醇和丙酮的混合物，去離子水和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，或乙醇、丙酮和N，N-二甲基 甲酰胺的混合物。
[0032] 優(yōu)選地，步驟（3)所述共價(jià)結(jié)合的方