膠體試劑的試紙的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熒光S12膠體試劑的制備方法及使用熒光S12膠體試劑的試紙。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫層析技術(shù)目前最常用的方法為免疫膠體金層析技術(shù)，其基本過程是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。
[0003]免疫膠體金層析技術(shù)自從上世紀70年代被提出以來，已在生物醫(yī)學(xué)，特別是醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域獲得了飛躍式發(fā)展，目前已有各種試紙條的開發(fā)和面市。作為診斷試劑，免疫膠體金試紙條具有結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、靈敏度和準確度較高等特點。這類試紙條的基本特點是依靠膠體金特殊聚集狀態(tài)下的顏色對檢測結(jié)果作出判斷，應(yīng)用的前提是被檢物本身的顏色不能干擾膠體金條帶的顏色，否則難以對結(jié)果作出明確判斷。但在實際應(yīng)用過程中所接觸到的大部分待檢樣品為有色液體，如釀造行業(yè)中的醬油、食醋等均具有較深的顏色，大多數(shù)農(nóng)產(chǎn)品和加工食品的提取液也不是無色透明的液體，醫(yī)學(xué)檢驗時所用人體體液(血清、尿液等)也具有特定顏色，這些待檢樣本自身固有顏色會掩蓋膠體金條帶的顏色，嚴重時無法讀取檢測結(jié)果。因此，為了擴大該技術(shù)方法的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍，特提出本發(fā)明，其基本特征是以免疫熒光S12納米粒子膠體代替免疫金膠體，以熒光代替納米金粒子的自身顯色，突破了傳統(tǒng)免疫膠體金試紙無法檢測有色樣品的限制，擴大了應(yīng)用領(lǐng)域并提高了檢測靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供熒光S1J^體試劑的制備方法，以及使用熒光S1J^體試劑制作檢測靈敏度高、能夠檢測有色樣品的免疫層析試紙。
[0005]為了達成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]熒光S12膠體試劑的制備方法
[0007]包括以下步驟:
[0008]I)制備氨基修飾的熒光S1^米粒子:利用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)、環(huán)己烷、正己醇和水形成微乳體系的液體，在微乳體系中加入二氯化三聯(lián)吡啶釕六水合物([Ru(bpy)3]2+Cl_2.6H20)溶液后攪拌，繼續(xù)加入正硅酸四乙酯(TEOS)、氨水之后，形成核殼結(jié)構(gòu)，繼續(xù)加入正硅酸乙酯(TEOS)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(triethoxysilane)，得到氨基修飾的3;102納米粒子溶液，經(jīng)過破乳、清洗、干燥后得到焚光Si02m米粒子；
[0009]2) S12納米氨基的羧基化:利用N，N-二甲基甲酰胺對步驟I)中得到的納米粒子進行清洗、攪拌得到羧基化的熒光s12m米粒子；
[0010]3)通過羧基化熒光S12納米粒子與抗體蛋白的偶聯(lián)，得到抗體致敏的熒光Si02m米粒子。
[0011]步驟I)的具體步驟如下:
[0012]1-1)利用Triton-XlOO、環(huán)己烷、正己醇和水在攪拌設(shè)定時間后形成微乳體系；
[0013]1-2)在步驟1-1)得到的微乳體系中加入濃度為100mg/ml的[Ru (bpy) 3]2+Cl_2.6H20 水溶液后，進行攪拌，[Ru (bpy) 3]2+Cl_2.6H20 水溶液與步驟 1-1)中加入水的體積比是1:2 ；
[0014]1-3)在步驟1-2)得到的溶液中加入與步驟1-2)中[Ru(bpy)3]2+Cl_2.6H20同體積的TEOS后進行攪拌，加入氨水后，在室溫條件下，攪拌，使得溶液中形成核殼結(jié)構(gòu)，進行靜置;
[0015]1-4)向步驟1-3)中得到的溶液中加入步驟1-3)中TEOS體積3/5的TEOS和步驟1-3)中TEOS體積3/5的triethoxysilane，在室溫條件下，繼續(xù)攪拌后，得到氨基修飾的Si02m米粒子；
[0016]1-5)在步驟1-4)中得到的溶液中加入丙酮，進行破乳，分別用乙醇和PBS(pH =6.8)對破乳后的溶液清洗數(shù)次，得到納米粒子，將得到的納米粒子真空冷凍干燥。
[0017]步驟2)的具體步驟如下:
[0018]2-1)將步驟I)中得到的Si02m米粒子，在氮氣的保護下，加入質(zhì)量濃度在8% -15%的琥珀酸酐N，N- 二甲基甲酰胺溶液；
[0019]2-2)持續(xù)通氮氣，連續(xù)攪拌反應(yīng)，得到離心的羧基化S12納米粒子；
[0020]2-3)將步驟2-2)得到的離心的羧基化S12納米粒子沉淀，對其充分干燥。
[0021]步驟3)的具體步驟如下:
[0022]3-1)取設(shè)定質(zhì)量的1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液使之充分溶解，形成I液；
[0023]3-2)取設(shè)定質(zhì)量的羧基化的熒光S12納米粒子，用PBS溶液溶解，形成II液；
[0024]3-3)取待標記抗體蛋白，溶于PBS中，形成III液；
[0025]3-4)將步驟3-2)獲得的II液和步驟3_3)獲得的III液混合，在磁力攪拌下逐滴加入步驟3-1)獲得的部分I液；
[0026]3-5)在室溫條件下，對步驟3-4)獲得的溶液在避光條件下，繼續(xù)逐滴加入余下的I液；
[0027]3-6)在4°C的條件下，對步驟3-5)獲得的溶液攪拌；
[0028]3-7)在4°C的條件下，對步驟3-6)獲得的溶液靜置；
[0029]3-8)用設(shè)定濃度的PBS溶液對3-7)獲得的物質(zhì)清洗三次，干燥后，獲得抗體致敏的熒光S12膠體試劑。
[0030]步驟1-1)中Triton-XlOO、環(huán)己烷、正己醇和水的體積比是17.7:75:16:2。
[0031]步驟3-1)中的EDC的質(zhì)量與所述步驟3-2)中熒光S12納米粒子的質(zhì)量比是4:1。
[0032]熒光S12膠體免疫層析試紙的裝配:
[0033]在底襯上依次貼下端樣品吸收墊、硝酸纖維素膜和上端樣品吸收墊，底襯為透明PVC底襯，在下端樣品吸收墊與硝酸纖維素膜之間搭接熒光S12膠體結(jié)合墊，在硝酸纖維素膜上設(shè)有兩條平行的檢測線T和質(zhì)控線C，在下端樣品吸收墊上依次設(shè)置檢測液面下線和檢測液面上限，用于使用時提示操作者正常的浸漬范圍。
[0034]在所述熒光S12膠體結(jié)合墊內(nèi)含有對待檢物的特異性抗體的致敏熒光S1 2粒子復(fù)合物。
[0035]檢測線T包含待檢物-BSA(牛血清白蛋白)載體復(fù)合物。
[0036]質(zhì)控線C內(nèi)含兔抗鼠IgG 二抗。
[0037]本發(fā)明的有益效果
[0038]I)通過制備氨基修飾的熒光Si02m米粒子、羧基化熒光S1 2納米粒子和將羧基化LDS粒子與抗體蛋白的偶聯(lián)來制造熒光S12膠體試劑，制作過程簡易可行；
[0039]2)利用熒光S12膠體試劑與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，制備的檢測試紙，可以實現(xiàn)定性檢測和定量檢測；
[0040]3)該試紙能檢測有色樣品，擴大了應(yīng)用領(lǐng)域；
[0041]4)該試紙檢測結(jié)果條帶為熒光顯示，故能排除背景顏色的干擾，提高檢測的靈敏度，無機S12膠體熒光基團性質(zhì)穩(wěn)定，發(fā)光效率高，耐儲存。
【附圖說明】
[0042]圖1是本發(fā)明中試紙結(jié)構(gòu)原理圖；
[0043]圖2是本發(fā)明檢測效果圖；
[0044]其中，1.檢測液面下限；2.下端樣品吸收墊；3.檢測液面上限；4.熒光S12膠體結(jié)合墊；5.檢測線T ;6.硝酸纖維素膜；7.質(zhì)控線C ;8.透明PVC底板；9.上端樣品吸收墊。
【具體實施方式】
[0045]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述。
[0046]Triton-XlOO (聚乙二醇辛基苯基醚，生工生物工程(上海)有限公司)；
[0047]環(huán)己烷(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);
[0048]正己醇(萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠)；
[0049][Ru(bpy)3]2+Cr2.6H20( 二氯化三聯(lián)吡啶釕六水合物，ALDRICH)；
[0050]TEOS (正硅酸四乙酯，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);
[0051]氨水(天津市化學(xué)試劑三廠)；
[0052]triethoxysilane (3_ 氨基丙基三乙氧基娃燒，ALDRICH)；
[0053]丙酮(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);
[0054]琥珀酸酐(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；
[0055]EDC(1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺(上海思域化工科技有限公司)
[0056]琥珀酸酐N，N- 二甲基甲酰胺溶液:將琥珀酸酐溶解到N，N- 二甲基甲酰胺溶劑當(dāng)中。
[0057]熒光S12膠體試劑的制作步驟
[0058]1.制備氨基修飾的熒光Si02m米粒子(LDS)
[0059]首先取1.77mlTriton-X100,7.5ml環(huán)己烷、L 6ml正己醇和200 μ I水于室溫下磁力攪拌1min后形成微乳體系，然后在此體系中加入100 μ I濃度為10mg/ml 的[Ru