一種促黃體生成素(lh)化學發(fā)光免疫分析法定量檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】：
[0001]本發(fā)明涉及促黃體生成素（LH)化學發(fā)光免疫分析法定量測定試劑盒，屬于化學 發(fā)光免疫分析法檢測領域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 促黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH)是人體中重要的內(nèi)分泌激素。內(nèi)分泌 功能障礙，可導致人體多種疾病的發(fā)生，因此準確檢測體內(nèi)激素水平對診斷內(nèi)分泌疾病有 著重要的意義。
[0003] 促黃體生成素（LH)與促卵泡刺激素（FSH) -樣同屬促性腺激素家族，二者協(xié)同調(diào) 節(jié)和刺激性腺（卵巢和睪丸）的發(fā)育和功能。與FSH、TSH(促甲狀腺激素）和hCG(人絨 毛膜促性腺激素）一樣，LH也是糖蛋白，由兩種亞單位（a和0)組成，含121個氨基酸和 3條糖鏈，分子量29. 5kD。在有卵泡刺激素存在下，與其協(xié)同作用，刺激卵巢激素分泌，使卵 泡成熟與排卵，使破裂卵泡形成黃體并分泌雌激素和孕激素。刺激睪丸間質(zhì)細胞發(fā)育并促 進其分泌睪酮。故又稱間質(zhì)細胞促進素。促黃體生成素的分泌受下丘腦促黃體生成素釋放 激素的調(diào)節(jié)，是由腦垂體千葉分泌的促性腺素的一種，作用于卵巢的黃體或黃體細胞，促進 孕激素的分泌。
[0004]對于女性，該激素在下丘腦-垂體-卵巢調(diào)節(jié)環(huán)路中發(fā)揮作用，控制月經(jīng)周期。LH 和FSH從垂體的促性腺細胞中陣發(fā)性的釋放，經(jīng)血流到達卵巢，在卵巢中LH和FSH -起刺 激卵泡的成長和成熟，進而刺激雌激素和雄激素的生物合成。LH水平在月經(jīng)周期的中期呈 現(xiàn)最高峰，誘導排卵和形成黃體，其主要分泌物是雄激素。在睪丸的Leyding細胞內(nèi)，LH刺 激睪酮的產(chǎn)生。LH檢測對查明下丘腦-垂體-卵巢系統(tǒng)的功能失常有作用。LH和FSH聯(lián) 合檢測還可以用于查明染色體異常的先天性的疾病、多囊性卵巢（PC0)、閉經(jīng)的病因、絕經(jīng) 綜合征和疑有間質(zhì)細胞發(fā)育不全。
[0005] 目前血清LH檢測主要有酶免疫法（ELISA)、免疫放射法（IRMA)、時間分辨熒光免 疫測定（TRFIA)。由于受示蹤劑性狀的限制，ELISA的靈敏度不高，檢測范圍有限；IRMA試 劑盒受同位素半衰期的影響，有效期短，此外還有一定的放射性污染；當進行超微量分析的 時候，TRFIA受激發(fā)光的雜散光的影響很嚴重。
[0006]化學發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA)，是將具有高靈敏 度的化學發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、 酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時 間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術(shù)。主要具有靈敏度高、試劑價 格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期（6-18個月）、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、安全無毒無污染、操 作簡單自動化程度高等優(yōu)點，成為取代放射免疫分析和酶免疫分析技術(shù)的首選。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種用于LH化學發(fā)光免疫分析法定量檢測的試劑盒，主要 解決現(xiàn)有LH檢測領域存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、操作繁瑣、污染環(huán)境、試劑不穩(wěn)定且價格 昂貴等問題。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案：本發(fā)明描述的促黃體生成素（LH)化學發(fā)光免疫分析法定量 檢測試劑盒包括微孔板、校準品、標記物、發(fā)光底物A、發(fā)光底物B、濃縮洗滌液。本試劑盒采 用夾心法測定血清中LH水平，以抗LH抗體作為包被抗體，加入LH校準品或待測血清后，再 加入另一株抗LH抗體標記物進行反應，充分洗滌后加入發(fā)光底物測定其發(fā)光強度（RLU)， 根據(jù)標準曲線即可算出樣品中LH的含量，樣品的RLU值隨LH濃度的增加而上升。
[0009] 本發(fā)明的基本操作如下：
[0010] 1. LH抗體包被微孔板的制備
[0011] ①包被緩沖液的制備
[0012] 檸檬酸三鈉 7.0~7.4g
[0013]檸檬酸 4.2~4.6g
[0014] 純化水加至 1000ml
[0015] 將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0016] ②包被工作液的制備
[0017] 取促黃體生成素（LH)，按1 y g/ml的濃度加入①中制備的包被緩沖液中，攪拌混 勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0018] ③封閉液的制備
[0020] 將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0021] ④LH抗體包被微孔板的制備過程；
[0022] a)按所需的數(shù)量準備發(fā)光微孔板；
[0023] b)使用包被機進行包被，每孔加入100~120 y 1的包被工作液，震蕩混勾，移入冰 箱（2~8°C )靜置16-20小時；
[0024] c)取出步驟b)靜置后的微孔板，使用包板機每孔分別加入封閉液300~350 y 1， 37 °C，放置1小時；
[0025] d)甩掉孔內(nèi)的封閉液，然后在吸水紙上拍干。將拍干的微孔板放入干燥間干燥 6-8小時。
[0026] e)從干燥間中取出，立即進行封袋，2~8°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 2.酶標記物的制備
[0028]①酶稀釋液的配制
[0029]
[0030] 將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0031] ②PB緩沖液的配制
[0032] 磷酸二氫鈉 0? 9~1. lg
[0033] 磷酸氫二鈉 5. 0~5. 3g
[0034] 純化水加至 1000ml
[0035] 將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0036] ③酶標記物的制備
[0037] a)按辣根過氧化物酶：LH = 1 : 1的比例混合，加入1. 5當量碳二亞胺，混勻后 室溫反應1-3小時；
[0038] b)轉(zhuǎn)入透析袋中透析，用步驟②配制的PB緩沖液透析過夜；
[0039] c)轉(zhuǎn)入玻璃瓶，加入質(zhì)量分數(shù)1 %小牛血清白蛋白及質(zhì)量分數(shù)1 %丙三醇，2~8°C 保存；
[0040] d)將標記物按稀釋度1 : 20000稀釋，2~8°C密封保存?zhèn)溆茫?br>[0041] 3?濃縮洗滌液的配制
[0043] 將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0044] 4.化學發(fā)光底物的制備
[0045] ①化學發(fā)光底物液A的配制
[0047] 將上述試劑稱量好放入黑色潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C密封避光保存?zhèn)溆谩?br>[0048] ②化學發(fā)光底物液B的配制
[0049]
[0050] 將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0051] 5促黃體生成素（LH)定量檢測試劑盒的使用
[0052] ①取出實驗中所需的LH抗體包被微孔板、LH標準原料、HRP標記的LH抗體及待測 樣品，待溫度與室溫（25°C )平衡15分鐘以后使用；
[0053] ②每孔先加入25ul的校準品或待測樣本，再加入150ul的標記物，用微量震蕩器 充分振蕩混勻，37°C溫育30-45分鐘。用稀釋后的洗滌液洗板5次，最后在干凈的吸水紙上 扣干；
[0054] ③每孔加100UL發(fā)光底物混合液；
[0055] ④步驟③中發(fā)光底物混合液是在潔凈容器中預先將發(fā)光底物A魯米諾和發(fā)光底 物B雙氧水以1 : 1的比例混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0056] ⑤用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，在化學發(fā)光免疫分析儀上依序測量各孔的發(fā) 光強度（RLU)，測量時間1秒/孔，必須于加化學發(fā)光底物液后的第1-3分鐘內(nèi)測量。
[0057] ⑥待測樣品的濃度計算按下列方法進行：用化學發(fā)光免疫分析儀中的數(shù)據(jù)處理程 序（擬合類型：線性擬合，坐標選擇 ：l〇g(X)-log(Y)，實驗方法：夾心法。進行直線擬合時， 校準品和樣品發(fā)光信號應扣除〇點校準品發(fā)光信號）直接給出校準曲線及樣品的濃度值。
[0058]⑦步驟⑥中數(shù)據(jù)處理程序特征是擬合類型：線性擬合，坐標選擇：l〇g(X)-l〇g(Y)， 實驗方法：夾心法。進行直線擬合時，校準品和樣品發(fā)光信號應扣除〇點校準品發(fā)光信號。
【具體實施方式】：
[0059] 實施例1
[0060] (1)LH抗體包被微孔板的配制
[0061] ①包被緩沖液的配制
[0062] 檸檬酸三鈉 7. 0g
[0063] 檸檬酸 4. 2g
[0064] 純化水加至 1000ml
[0065] 將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0066] ②包被工作液的制備
[0067] 取促黃體生成素（LH)，按1 y g/ml的濃度加入步驟①中制備的包被緩沖液中，攪 拌混勻，2~8°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0068]③封閉液的制備
[0069]
[0070] 將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，溶解混勻，2~8°C保存?zhèn)?