用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法，其中，對(duì)試樣在測(cè)量區(qū)域中以發(fā)光阻抑光的具有局部最小處的強(qiáng)度分布加載，其中，對(duì)試樣在測(cè)量區(qū)域中以發(fā)光激發(fā)光加載，所述發(fā)光激發(fā)光使發(fā)光體從電子基態(tài)出發(fā)被激發(fā)到發(fā)光狀態(tài)，其中，記錄從測(cè)量區(qū)域所發(fā)射的冷光，并且，將所記錄的冷光對(duì)應(yīng)于所述局部最小處在試樣中的位置。
[0002]在這樣的方法中，由測(cè)量區(qū)域所發(fā)射的冷光的強(qiáng)度是發(fā)光體在局部最小處在試樣中的位置上的濃度的尺度。通過(guò)在局部最小處的每個(gè)位置上重復(fù)上述步驟來(lái)掃描具有局部最小處的試樣，檢測(cè)發(fā)光體在試樣中的分布并且因此對(duì)具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)成像。
[0003]在這里，用術(shù)語(yǔ)“發(fā)光體”是指這樣的任意物質(zhì):當(dāng)其處于被激發(fā)的發(fā)光態(tài)時(shí)，從該物質(zhì)可獲得作為測(cè)量信號(hào)的熒光。熒光染料尤其屬于這樣的物質(zhì)。但是，該以基于冷光發(fā)射的過(guò)程不必是熒光。也可以涉及散射、例如Raman散射，在所述散射中，從被激發(fā)的過(guò)渡狀態(tài)發(fā)射散射光，所述被激發(fā)的過(guò)渡狀態(tài)被看作被激發(fā)的發(fā)光態(tài)。
[0004]試樣的讓人感興趣的結(jié)構(gòu)可以本身具有發(fā)光體，即為自動(dòng)發(fā)光的。然而，試樣的讓人感興趣的結(jié)構(gòu)也可以以發(fā)光體人工標(biāo)記。以發(fā)光體對(duì)結(jié)構(gòu)的人工標(biāo)記例如可以通過(guò)所謂的抗體染色、即通過(guò)發(fā)光體通過(guò)免疫反應(yīng)連接，或者通過(guò)基因技術(shù)的改變來(lái)進(jìn)行，所述基因技術(shù)的改變導(dǎo)致發(fā)光體與讓人感興趣的結(jié)構(gòu)的共同表達(dá)。
[0005]如果在這里談到一種狀態(tài)、例如發(fā)光體的可激發(fā)的電子基態(tài)或者被激發(fā)的發(fā)光態(tài)，則涉及發(fā)光體的能發(fā)光的最小單元即分子、復(fù)合物、缺陷處、量子點(diǎn)或者諸如此類的電子狀態(tài)。
[0006]如果在這里談?wù)摰氖枪?、例如發(fā)光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處，則以此尤其指的是強(qiáng)度分布的由干涉所產(chǎn)生的零位置。這樣的零位置可以具有四個(gè)比它在光聚焦時(shí)由于衍射極限而可能的更小的尺寸。在此也能涉及真實(shí)的零位置，在該零位置中，光的強(qiáng)度實(shí)際上返回到零，或者涉及一種這樣的零位置:在該零位置中，光的強(qiáng)度由于缺乏理想的光學(xué)情況而僅基本上返回到零。如果在這里談到局部最小處的大小，則該大小尤其涉及體積的大小，在該體積中，相應(yīng)的光造成通過(guò)該光所追求的效果、例如通過(guò)該光激發(fā)過(guò)渡未至飽和。
【背景技術(shù)】
[0007]一種已知的用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)在空間上高分辨率成像的方法作為GSD(基態(tài)耗竭，Ground State Deplet1n)網(wǎng)柵熒光顯微鏡已知，該方法以上述順序包括獨(dú)立權(quán)利要求1前序部分的步驟。在這種已知的方法中，以呈GSD光形式的發(fā)光阻抑光使發(fā)光體經(jīng)過(guò)其電子被激發(fā)發(fā)光態(tài)、例如電子被激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)為暗態(tài)、例如長(zhǎng)壽命的三重態(tài)，發(fā)光體不被發(fā)光激發(fā)光從暗態(tài)激發(fā)到發(fā)光態(tài)。這發(fā)生在發(fā)光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處之外各處，直至飽和。即，在以發(fā)光阻抑光加載之后，只在發(fā)光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處中發(fā)光體還處于其電子基態(tài)，發(fā)光體被發(fā)光激發(fā)光從電子基態(tài)激發(fā)到發(fā)光態(tài)。因此，在以發(fā)光激發(fā)光激發(fā)之后，由發(fā)光體發(fā)射的冷光僅來(lái)自發(fā)光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處，因此對(duì)應(yīng)于局部最小處在試樣中的位置。
[0008]在以關(guān)鍵詞GSD已知的方法中也存在發(fā)光體褪色的巨大風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榘l(fā)光體不但在其被以發(fā)光阻抑光所轉(zhuǎn)換到的長(zhǎng)壽命的暗態(tài)中而且在其在轉(zhuǎn)到其暗態(tài)中時(shí)中間占據(jù)的電子激發(fā)的發(fā)光態(tài)中以提高的程度例如傾向于與氧氣化學(xué)反應(yīng)和/或承受這樣的風(fēng)險(xiǎn):發(fā)光體被發(fā)光阻抑光或者發(fā)光激發(fā)光進(jìn)一步電子激發(fā)，從而發(fā)生發(fā)光體的光化學(xué)褪色。
[0009]另一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法作為 RESOLFT(可逆飽和焚光過(guò)渡 Reversible Saturable Optical FluorescenceTransit1ns)網(wǎng)柵熒光顯微鏡的變型已知，該RESOLFT網(wǎng)柵熒光顯微鏡使用所謂可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體，該方法以上述順序具有獨(dú)立權(quán)利要求1前序部分的方法步驟。借助于呈關(guān)斷光形式的發(fā)光阻抑光可將發(fā)光體從它在其中起發(fā)光體作用的第一構(gòu)象狀態(tài)轉(zhuǎn)換到它在其中不起發(fā)光體作用的第二構(gòu)象形態(tài)，即，在第二構(gòu)象狀態(tài)中，至少借助于在第一構(gòu)象狀態(tài)下適合于激發(fā)發(fā)光態(tài)的發(fā)光激發(fā)光不能將發(fā)光體激發(fā)到發(fā)光態(tài)，在發(fā)光態(tài)下，發(fā)光體發(fā)射被記錄為測(cè)量信號(hào)的冷光。為了在發(fā)光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處之外各處促進(jìn)這樣的轉(zhuǎn)換直至飽和，在第二構(gòu)象狀態(tài)的壽命足夠長(zhǎng)的情況下，僅需要相對(duì)小的光強(qiáng)度。此外不存在被轉(zhuǎn)換到其另一構(gòu)象狀態(tài)中的發(fā)光體從該另一構(gòu)象狀態(tài)褪色出來(lái)的顯著風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榘l(fā)光體在該構(gòu)象狀態(tài)下對(duì)發(fā)光阻抑光和發(fā)光激發(fā)光不響應(yīng)。然而，可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體借助于發(fā)光阻抑光向其第二構(gòu)象狀態(tài)的轉(zhuǎn)換也經(jīng)過(guò)被激發(fā)的電子態(tài)進(jìn)行，該被激發(fā)的電子態(tài)在發(fā)光阻抑光的強(qiáng)度較高的情況下可以是用于發(fā)光體的光化學(xué)褪色的起點(diǎn)。由于該原因和其它原因，在有多個(gè)可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體時(shí)，兩種構(gòu)象狀態(tài)之間的可用的轉(zhuǎn)換過(guò)程的絕對(duì)數(shù)量是受限的，尤其當(dāng)發(fā)光體根據(jù)需求主動(dòng)地、即通過(guò)發(fā)光促進(jìn)光從其不能發(fā)光的第二構(gòu)象狀態(tài)切換到其能發(fā)光的第一構(gòu)象狀態(tài)時(shí)。此外，即使在所述構(gòu)象狀態(tài)之間主動(dòng)地來(lái)回切換，所述構(gòu)象狀態(tài)的已經(jīng)提到的長(zhǎng)壽命意味著:以關(guān)鍵詞RESOLFT已知的用于試樣的具有可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法也相對(duì)較慢。最后，商業(yè)上可用的適合于標(biāo)記試樣中的結(jié)構(gòu)的可轉(zhuǎn)換發(fā)光體的數(shù)量是有限的，尤其與大量原則上可用的發(fā)光體相比。而且開發(fā)新的穩(wěn)定的可轉(zhuǎn)換發(fā)光體是費(fèi)事的。
[0010]一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率地成像的方法作為STED(受激輻射耗竭)網(wǎng)柵熒光顯微鏡已知，該方法以原則上與開頭部分所列舉的不同的順序包括獨(dú)立權(quán)利要求1前序部分的方法步驟。在這里，首先對(duì)試樣在測(cè)量區(qū)域中以發(fā)光激發(fā)光加載，發(fā)光激發(fā)光將發(fā)光體從電子基態(tài)激發(fā)到發(fā)光態(tài)。然后對(duì)試樣在測(cè)量區(qū)域中以呈STED光形式的發(fā)光阻抑光的具有局部最小處的強(qiáng)度分布加載，發(fā)光阻抑光使被激發(fā)的發(fā)光態(tài)通過(guò)受激發(fā)射再退激發(fā)到基態(tài)。當(dāng)發(fā)光阻抑光使被激發(fā)的發(fā)光態(tài)在局部最小處之外各處通過(guò)受激發(fā)射又被退激發(fā)時(shí)，接著由測(cè)量區(qū)域發(fā)射的熒光只可能來(lái)自發(fā)光退激發(fā)光的強(qiáng)度分布的局部最小處，因此對(duì)應(yīng)于局部最小處在試樣中的位置。
[0011]在以關(guān)鍵詞STED已知的方法中，在試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的成像中實(shí)際也達(dá)到非常高的地點(diǎn)分辨率。然而在此，發(fā)光體顯著承受光化學(xué)負(fù)荷并且因此強(qiáng)烈地傾向于褪色。原因在于，發(fā)光退激發(fā)光加載已經(jīng)處于其被激發(fā)的發(fā)光狀態(tài)下的發(fā)光體，該發(fā)光退激發(fā)光為了約束其強(qiáng)度分布的呈零位置形式的局部最小處而必須以高的絕對(duì)強(qiáng)度來(lái)施加。因此，除了所希望的使發(fā)光體返回其基態(tài)的受激發(fā)射外，其它過(guò)程、尤其發(fā)光體的在更大程度上并且導(dǎo)致褪色的電子激勵(lì)也不是不可能的。對(duì)起先通過(guò)手激發(fā)射而被退激發(fā)的發(fā)光體的重新激發(fā)也可通過(guò)本來(lái)設(shè)置用于熒光退激發(fā)的光發(fā)生。
[0012]所有已知的、具有獨(dú)立權(quán)利要求1前序部分的特征的、用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法基于:發(fā)光阻抑光使發(fā)光體或者在發(fā)光激發(fā)光射入之前從其能發(fā)光的基態(tài)經(jīng)過(guò)被激發(fā)的電子態(tài)轉(zhuǎn)換到暗態(tài)，或者從被激發(fā)的發(fā)光態(tài)返回到基態(tài)。即，在任何情況下，發(fā)光體被加載以高強(qiáng)度的、具有在發(fā)光體的吸收光譜中的波長(zhǎng)的發(fā)光阻抑光，并且，與發(fā)光體的光化學(xué)褪色危險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的、被激發(fā)的電子態(tài)借助于發(fā)光阻抑光而參與到地點(diǎn)分辨率的提高中。而且，似乎在暗態(tài)壽命和必需的發(fā)光阻抑光強(qiáng)度之間產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，暗態(tài)壽命越長(zhǎng)，該關(guān)聯(lián)越少可能失效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的任務(wù)是，提出一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法，在該方法中，發(fā)光體承受特別小的光化學(xué)褪色，但在掃描具有發(fā)光阻抑光的強(qiáng)度分布的最小處的試樣時(shí)仍允許高的速度。
[0014]本發(fā)明的該任務(wù)通過(guò)具有獨(dú)立權(quán)利要求1的特征的方法解決。在從屬權(quán)利要求中定義根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方式。
[0015]在用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)空間高分辨率成像的方法中，對(duì)試樣在測(cè)量區(qū)域中以發(fā)光阻抑光的具有局部最小處的強(qiáng)度分布加載，其中，對(duì)試樣在測(cè)量區(qū)域中以發(fā)光激發(fā)光加載，該發(fā)光激發(fā)光使發(fā)光體從電子基態(tài)出發(fā)被激發(fā)到發(fā)光態(tài)，其中，記錄從測(cè)量區(qū)域所發(fā)射的冷光，將所記錄的冷光對(duì)應(yīng)于局部最小處在試樣中的位置，在該方法中，以發(fā)光阻抑光這樣干擾發(fā)光體的電子基態(tài)，使得發(fā)光體在被干擾的電子基態(tài)中具有用于發(fā)光激發(fā)光的減小至少50%的吸收橫截面。在評(píng)估用于發(fā)光激發(fā)光的吸收橫截面時(shí)的比較標(biāo)準(zhǔn)在這里為未被干擾的基態(tài)，在該未被干擾的基態(tài)中，發(fā)光體具有其用于發(fā)光激發(fā)光的100%吸收橫截面。
[0016]在根據(jù)本發(fā)明的方法中，發(fā)光體不被發(fā)光阻抑光從電子基態(tài)引出或者從其它電子態(tài)返回到電子基態(tài)。即，不進(jìn)行發(fā)光體的電子態(tài)的改變。取而代之，發(fā)光體的現(xiàn)有電子基態(tài)被干擾。該干擾至少到這個(gè)程度:使得發(fā)光體在被干擾的電子基態(tài)中與在未被干擾的電子基態(tài)中相比以最大一半概率被發(fā)光激發(fā)光激發(fā)到發(fā)光態(tài)。然而，典型地，該干擾還可更進(jìn)一步，使得吸收橫截