I相和ii相代謝物以及母體化合物的分析的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明總體上涉及通過色譜的樣品分析領(lǐng)域，并且更具體來說，涉及生物樣本中的藥物化合物濃度的定量分析。
【背景技術(shù)】
[0002]液相色譜-質(zhì)譜(“LCMS”)是一種強(qiáng)大的分析物檢測(cè)和測(cè)量技術(shù)，它已經(jīng)變成了為了診斷目的用于高精度地檢測(cè)小分子、氨基酸、蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)以及碳水化合物分析物的優(yōu)選方法。色譜分離過程依賴這樣的事實(shí)，通過顆粒的填充床(被稱為固定相)滲濾的流體的流動(dòng)流束中的許多組分溶質(zhì)分子可以有效地彼此分開?？傮w上，液相色譜中的分離是在柱中通過樣品分子在固定相和流動(dòng)相之間的選擇性分布來實(shí)現(xiàn)。單獨(dú)的樣品組分被分離，因?yàn)槊總€(gè)組分對(duì)固定相具有不同的親和力，導(dǎo)致每個(gè)組分不同的迀移率和每個(gè)組分從柱出現(xiàn)的不同的退出時(shí)間。分離效率是由溶質(zhì)帶穿過該床或柱時(shí)鋪展的量來確定。
[0003]反相液相色譜(RPLC)被廣泛地用作色譜系統(tǒng)中的分離模式。在RPLC技術(shù)中，在流動(dòng)相中采用的一種或多種溶劑的極性比固定相更大，然而在常規(guī)(正相)色譜中，相反的情況是正確的。在反相液相色譜系統(tǒng)中典型地采用的流動(dòng)相溶劑包括水和一種或多種水可混溶的有機(jī)改性劑，例如乙腈或甲醇。感興趣的分析物種類典型地與流動(dòng)相形成溶液。RP-HPLC固定相通常是高度疏水性或非極性的?；瘜W(xué)種類對(duì)固定相的親和力影響流動(dòng)的流動(dòng)相中的特定種類穿過固定相的速率，主要是由該種類與固定相上所存在的化學(xué)基團(tuán)的相互相用造成的。這些化學(xué)基團(tuán)可以通過使表面改性試劑與襯底(例如二氧化硅襯底)反應(yīng)而提供在固定相上。因此，表面改性劑可以用于將特定的化學(xué)基團(tuán)吸附到固定相上。常規(guī)反相液相色譜使用1.5-10 μ m球形二氧化硅珠粒，這些球形二氧化硅珠粒已經(jīng)通過共價(jià)連接包括4、8或18個(gè)碳原子的烴鏈加以改性，從而得到非極性表面。
[0004]臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)地測(cè)量人類提供的體液中的藥物化合物(包括藥類化合物以及其他濫用的天然和合成藥物)的濃度。這些化合物總體上包括低分子量分子，這些低分子量分子的親水性極大并且難以保留在大部分反相LC系統(tǒng)上。代謝物的親水性甚至更大并且甚至更難以保留在逆相LC系統(tǒng)上。替代性HPLC系統(tǒng)例如采用HILIC柱的那些，保留代謝物但不保留所有母體化合物。因此，使用色譜分離技術(shù)定量藥物化合物非常具有挑戰(zhàn)性。出于這個(gè)原因，當(dāng)前濫用藥物的臨床定量通過以下來執(zhí)行:11相代謝物和一些I相代謝物的水解(通過酸水解或者通過酶促水解)，以便將代謝物轉(zhuǎn)化回到母體化合物，并且隨后只有母體化合物的LCMS測(cè)量是必需的。代謝物和母體藥物的總濃度合起來報(bào)告為一個(gè)單值，因?yàn)榇x物已經(jīng)在水解期間被轉(zhuǎn)化回到母體藥物。酸水解或者酶促水解需要一個(gè)處理步驟，接著是在高溫下長達(dá)2小時(shí)的培育。因此，水解程序給每個(gè)分析增加了額外的時(shí)間和成本。
[0005]根據(jù)以上討論，在本領(lǐng)域中需要一種用于藥物化合物的例行臨床測(cè)量的快速并且可靠的色譜分離和分析方法，例如不需要附加的水解步驟的LCMS方法。還需要能夠?qū)嵤┻@些新方法的新色譜設(shè)計(jì)。令人遺憾的是，LCMS所需的常規(guī)儀器是技術(shù)上復(fù)雜的并且不是非常適合典型的醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員。這些臨床實(shí)驗(yàn)室尚未采用LCMS診斷，并且實(shí)際上，總體上使用替代性診斷技術(shù)，包括自動(dòng)化免疫分析?？商娲?，臨床實(shí)驗(yàn)室可以把樣品發(fā)送到中心參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。
[0006]然而，最近，適用于例行臨床和醫(yī)院用途的自動(dòng)化分析儀最近已在名稱為“用于樣品制備和分析的自動(dòng)化系統(tǒng)(Automated System for Sample Preparat1n andAnalysis)”的國際專利申請(qǐng)(PCT)公開WO 2012/058632A1中有所描述。適配此類自動(dòng)化分析儀以便進(jìn)一步包括使用常規(guī)水解方法中的一種例行分析濫用藥物將需要離線水解，接著將所處理的樣品轉(zhuǎn)移到自動(dòng)化分析儀；或者機(jī)載自動(dòng)化機(jī)器人水解。這些修改中的任一種的實(shí)現(xiàn)都將需要附加的硬件并且增加了整體系統(tǒng)復(fù)雜性。此外，最新研宄(Wang等人，“使用葡糖苷酸代謝物的酶促水解，尿液中的處方阿片類藥物的不完全恢復(fù)(IncompleteRecovery of Prescript1n Op1ids in Urine using Enzymatic Hydrolysis ofGlucuronide Metabolites) ”，《分析毒物學(xué)雜志》(Journal of Analytical Toxicology),第30卷，2006年10月，第570-575頁)已經(jīng)作出以下結(jié)論:關(guān)于尿液樣品中的至少阿片類藥物，酸水解比酶促水解釋放出更大比例的母體藥物化合物并且引入了更小的可變性。為了對(duì)這些樣品實(shí)施顯然優(yōu)選的酸水解方法，將需要附加的高昂的安全措施以防止實(shí)驗(yàn)室人員暴露于有害試劑。因此，在本領(lǐng)域中存在對(duì)可以用于使用自動(dòng)化臨床分析儀進(jìn)行藥物化合物的例行臨床測(cè)量的快速并且可靠的色譜分離和分析方法的特殊需要，所述快速并且可靠的色譜分離和分析方法例如不需要附加水解步驟的LCMS方法。
發(fā)明的披露
[0007]為了解決本領(lǐng)域中以上指出的需要，諸位發(fā)明人提供了允許去除水解步驟的用于定量生物樣品中的藥物化合物的方法和設(shè)備。根據(jù)本傳授內(nèi)容的方法包括在單一 LCMS運(yùn)行中使用兩根柱測(cè)量代謝物和母體化合物并且然后報(bào)告所有相關(guān)化合物的總和，以便計(jì)算初始母體化合物的濃度并且推導(dǎo)出與通過執(zhí)行傳統(tǒng)水解將產(chǎn)生的相同的值。
[0008]因此，在本發(fā)明的一個(gè)第一方面中，提供一種用于檢測(cè)和定量樣品中的多種分析物的液相色譜設(shè)備，其中該設(shè)備包括:第一色譜柱，它流體地聯(lián)接到樣品源和第一色譜流動(dòng)相溶液源；第二色譜柱，它流體地聯(lián)接到該第一色譜柱；第二流動(dòng)相溶液源，它流體地聯(lián)接在該第一和該第二色譜柱之間；以及檢測(cè)器，它流體地聯(lián)接到該第二色譜柱，其中該第一色譜柱是可配置的，從而在分析物捕集步驟中接收該第一流動(dòng)相溶液和該樣品并且將該多種分析物的第一部分保留在其中并且使該多種分析物的第二部分穿過其中，其中該第二色譜柱是可配置的，在該分析物捕集步驟中用于接收該多種分析物的該第二部分以及該第一和該第二流動(dòng)相溶劑并且將該多種分析物的該第二部分保留在其中，并且其中該檢測(cè)器被安排成用于分別在第一洗脫步驟中和在第二洗脫步驟中接收該多種分析物的該第二和該第一部分。在不同實(shí)施例中，制備型色譜柱可以流體地聯(lián)接在樣品源與第一色譜柱之間。該制備柱可以包括尺寸排阻親和柱。
[0009]該設(shè)備的不同實(shí)施例可以進(jìn)一步包括:T形接頭或梯度閥，它流體地聯(lián)接在第一和第二色譜柱之間并且流體地聯(lián)接到第二流動(dòng)相溶液源，其中該T形接頭或梯度閥被配置成使得在第一部分洗脫步驟期間，第二色譜柱接收來自第一色譜柱的多種分析物的第一部分?？商娲?，不同實(shí)施例可以進(jìn)一步包括:τ形接頭，它流體地聯(lián)接在第一和第二色譜柱之間并且可操作以將第一流動(dòng)相溶液和樣品的流動(dòng)劃分在第一和第二色譜柱之間；第一梯度閥，它流體地聯(lián)接在T形接頭與第一色譜柱之間并且也流體地聯(lián)接到第二流動(dòng)相溶液源；以及任選地，第二梯度閥，它流體地聯(lián)接在T形接頭與第二色譜柱之間并且也流體地聯(lián)接到第二流動(dòng)相溶液源。再者可替代地，不同實(shí)施例可以包括:第一多端口閥，它流體地聯(lián)接在第二色譜柱與檢測(cè)器之間并且可操作以在第一配置中，在第一部分洗脫步驟期間將多種分析物的第一部分轉(zhuǎn)移到檢測(cè)器；并且在第二配置中，在第二部分洗脫步驟期間將多種分析物的第二部分轉(zhuǎn)移到檢測(cè)器；以及在第三配置中，將第一或第二流動(dòng)相溶液中的任一個(gè)轉(zhuǎn)移到廢棄物容器。在這些情況下，第二多端口閥可以流體地聯(lián)接在第一和第二色譜柱之間，其中該第二多端口閥是可操作的，從而在第一配置中，在分析物捕集步驟期間將多種分析物的第二部分從第一色譜柱轉(zhuǎn)移到第二色譜柱；并且在第二配置中，在第一部分洗脫步驟期間將多種分析物的第一部分從第一色譜柱轉(zhuǎn)移到第一多端口閥。再者可替代地，不同實(shí)施例可以包括:T形接頭或梯度閥，它流體地聯(lián)接在第一和第二色譜柱之間并且流體地聯(lián)接到第二流動(dòng)相溶液源；第一多端口閥，它流體地聯(lián)接在第二色譜柱與檢測(cè)器之間并且可操作以在第一配置中，在第一部分洗脫步驟期間將多種分析物的第一部分轉(zhuǎn)移到檢測(cè)器并且在第二配置中，在第二部分洗脫步驟期間將多種分析物的第二部分轉(zhuǎn)移到檢測(cè)器，以及在第三配置中，將第一或第二流動(dòng)相溶液中的任一個(gè)轉(zhuǎn)移到廢棄物容器；以及選擇閥，它流體地聯(lián)接在第一色譜柱與T形接頭或梯度閥之間并且可操作以在第一配置中，在分析物捕集步驟期間將多種分析物的第二部分從第一色譜柱轉(zhuǎn)移到第二色譜柱并且在第二配置中，在第一部分洗脫步驟期間將多種分析物的第一部分從第一色譜柱轉(zhuǎn)移到第一多端口閥。
[0010]在本發(fā)明的一個(gè)第二方面中，提供了一種用于分析和定量包含多種藥物母體化合物和這些藥物母體化合物的多種代謝物的臨床樣品中的一組藥物的方法，其中該方法包括:(a)分別在第一色譜柱上和在第二色譜柱上捕集藥物母體化合物和代謝物的第一和第二部分；(b)從第一和第二色譜柱分別地洗脫藥物母體化合物和其代謝物的第一和第二部分；(C)用檢測(cè)器檢測(cè)從第一和第二色譜柱中的每一個(gè)洗脫的藥物母體化合物和代謝物中的每一個(gè)的濃度；以及(d)從每種對(duì)應(yīng)的藥物母體化合物的所檢測(cè)到的濃度連同所有其對(duì)應(yīng)的分析物的所檢測(cè)到的濃度一起計(jì)算樣品中的每種藥物的總濃度。在一些實(shí)施例中，臨床樣品可以在步驟(a)之前穿過制備柱。在不同實(shí)施例中，第一和第二色譜柱以及第一和第二流動(dòng)相溶液被配置成使得多種分析物的第一部分包括第一疏水性范圍并且多種分析物的第二部分包括第二疏水性范圍。優(yōu)選地，第一和第二疏水性范圍是不重疊的。在一些實(shí)施例中，藥物母體化合物和代謝物的第一部分僅包含藥物母體化合物并且第二部分僅包含代謝物。
[0011]在該方法的不同實(shí)施例中，步驟(a)可以包括:(al)將臨床樣品與第一流動(dòng)相溶液混合；和(a2)劃分樣品與第一流動(dòng)相溶液的混合物，使得所述混合物的第一部分傳遞到第一色譜柱中，使得藥物母體化合物和代謝物的第一部分被保留在其中；并且使得所述混合物的第二部分傳遞到第二色譜柱中，使得藥物母體化合物和代謝物的第二部分被保留在其中。在這些情況下，步驟(a)可以進(jìn)一步包括:(a3)將第二流動(dòng)相溶液混合到樣品與第一流動(dòng)相溶液的混合物的第一和第二部分中的至少一個(gè)中。在不同實(shí)施例中，步驟(b)可以包括以下步驟:(bl)劃分第一洗脫流動(dòng)相溶液，使得第一洗脫流動(dòng)相溶液的第一和第二部分分別傳遞到第一和第二色譜柱中。在這些情況下，步驟(b)可以進(jìn)一步包括以下附加步驟:(b2)將第二洗脫流動(dòng)相溶液混合到第一洗脫流動(dòng)相溶液的第一和第二部分中的至少一個(gè)中。
[0012]在該方法的不同替代實(shí)施例中，步驟(a)可以包括:(al)將臨床樣品與第一流動(dòng)相溶液混合；(a2)使樣品與第一流動(dòng)相溶液的混合物傳遞到第一色譜柱中，使得藥物母體化合物和代謝物的第一部分被保留在其中并且使得藥物母體化合物和代謝物的第二部分和第一流動(dòng)相溶液穿過其中；(a3)在它們穿過第一色譜柱之后，將第二流動(dòng)相溶液與第一流動(dòng)相溶液以及藥物母體化合物和代謝物的第二部分混合；以及(a4)使所混合的第一和第二流動(dòng)相溶液以及藥物母體化合物和代謝物的第二部分傳遞到第二色譜柱中，使得藥物母體化合物和代謝物的第二部分被保留在其中。然后，步驟(b)可以包括:(bl)使第一洗脫流動(dòng)相溶液穿過第一色譜柱，使得藥物母體化合物和代謝物的第一部分從第一色譜柱洗脫并且從那里傳遞到檢測(cè)器，而不穿過第二色譜柱；和(b2)使第二洗脫流動(dòng)相溶液穿過第二色譜柱，使得藥物母體化合物和代謝物的第二部分從第二色譜柱洗脫并且從那里傳遞到檢測(cè)器，而不穿過第一色譜柱?？商娲兀襟E(b)可以包括:(bl)使洗脫流動(dòng)相溶液穿過第二色譜柱，使得藥物母體化合物和代謝物的第二部分從第二色譜柱洗脫并且從那里傳遞到檢測(cè)器；和(b2)使另一個(gè)洗脫流動(dòng)相溶液穿過第一和第二色譜柱兩者，使得藥物母體化合物和代謝物的第一部分從第一色譜柱洗脫并且促使穿過第二色譜柱，而不保留在其中，到達(dá)檢測(cè)器。
[0013]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種自動(dòng)化樣品制備和分析系統(tǒng)，包括:(a)自動(dòng)化樣品制備站，用于根據(jù)多種化驗(yàn)制備多種樣品，這些化驗(yàn)選自包括多種獨(dú)特化驗(yàn)的數(shù)據(jù)庫；
(b)樣品分析站，用于自動(dòng)地執(zhí)行多種化驗(yàn)；以及(C)傳送機(jī)構(gòu)，用于將所制備的樣品從樣品制備站傳送到樣品分析站，其中該樣品分析站包括:(i)第一色譜流動(dòng)相溶液源；(ii)第二色譜流動(dòng)相溶液源；(iii)第一色譜柱，它流體地聯(lián)接到第一色譜流動(dòng)相溶液源并且被配置成用于從樣品傳送機(jī)構(gòu)接收所制備的樣品的一部分；(iv)第二色譜柱，它流體地聯(lián)接到第一色譜柱和第二色譜流動(dòng)相溶液源；以及(V)檢測(cè)器，它流體地聯(lián)接到第二色譜柱，其中第一色譜柱和第二色譜柱是可操作的，從而在捕集步驟期間分別捕集一組藥物化合物和其代謝物的第一部分和第二部分，并且將藥物化合物和其代謝物的第一和第二部分分別洗脫到檢測(cè)器中。
附圖簡(jiǎn)要說明
[0014]從下面僅以舉例方式并且參照未按比例繪制的附圖所給出的說明中，本發(fā)明的以上指出的和各種其他方面將變得清楚，在附圖中:
[0015]圖1A-1D是根據(jù)本傳授內(nèi)容的一個(gè)第一色譜系統(tǒng)的圖，展示了采樣和分析物捕集以及洗脫步驟；
[0016]圖1E-1G是根據(jù)本傳授內(nèi)容的一個(gè)第二色譜系統(tǒng)的圖，展示了分析物捕集和洗脫步驟；
[0017]圖2是一個(gè)多端口閥的一個(gè)示意性描繪，它可以用于圖1E-1G中所描繪的色譜系統(tǒng)中。
[0018]圖3A-3D是根據(jù)本傳授內(nèi)容的一個(gè)第三色譜系統(tǒng)的圖，展示了采樣和分析物捕集以及洗脫步驟；
[0019]圖4是根據(jù)本傳授內(nèi)容的一個(gè)第四色譜系統(tǒng)的圖；
[0020]圖5A是根據(jù)本傳授內(nèi)容根據(jù)一些實(shí)施例的一個(gè)自動(dòng)化樣品制備和分析系統(tǒng)的透視圖；
[0021]圖5B是根據(jù)本傳授內(nèi)容根據(jù)不同其他實(shí)施例的另一個(gè)自動(dòng)化樣品制備和分析系統(tǒng)的透視圖；
[0022]圖6是自動(dòng)化樣品制備和分析系統(tǒng)的組件的整體簡(jiǎn)圖；
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