一種具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸的還原能力測定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于固體廢物處理與資源化技術領域，具體涉及一種有機廢棄物中具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸的提取和還原能力的測定方法。
【背景技術】
[0002]有機廢棄物在放置和處理過程中會形成胡敏酸類物質，相對于土壤來源的胡敏酸而言，有機廢棄物來源的胡敏酸結構不穩(wěn)定，其中一部分組分可以很快被微生物降解利用。除了作為微生物營養(yǎng)功能外，胡敏酸還可以被氧化和還原，作為電子穿梭體介導電子傳遞，促進環(huán)境介質中污染物的降解和轉化。
[0003]胡敏酸穩(wěn)定還原能力的測定具有重要意義，以生活垃圾堆肥產品為例，當將堆肥施入土壤后，其中一部分作為碳源被降解利用，剩下的部分作為電子穿梭體穩(wěn)定得到或失去電子，作為氧化劑和還原劑，該部分對于土壤中污染物的降解和轉化具有重要意義。
[0004]胡敏酸電子轉移能力(即氧化和還原能力)的測定方法有電化學方法、Fe3+氧化法和H2S還原法，在這些方法中，電化學方法可以方便快捷的測定胡敏酸的氧化和還原能力，但是它測定是總的氧化和還原能力，對于有機廢棄物來源的不穩(wěn)定的胡敏酸組分，無法確定其中穩(wěn)定具有電子轉移能力的胡敏酸的量及其電子轉移能力。
[0005]一個可能的辦法是，先將胡敏酸中不能穩(wěn)定轉移電子有機物組分降解掉，然后獲得具有穩(wěn)定電子轉移能力的組分，再采用傳統(tǒng)滴定化學或電化學方法測定具有穩(wěn)定電子轉移能力胡敏酸的還原能力。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種有機廢棄物中具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸的提取和還原能力的測定方法，以測定胡敏酸中能穩(wěn)定進行還原能力的胡敏酸的還原能力。
[0007]為實現上述目的，本發(fā)明提供的有機廢棄物中具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸的還原能力測定方法，其主要步驟為:
[0008]I)提取有機廢棄物中粗胡敏酸組分:將NaOH和Na4P2O/混合液加入有機廢棄物中，室溫下避光震蕩，離心后取上清液，用HCl將上清液酸化至pH = 2，靜置，離心棄上清液，用超純水沖洗胡敏酸沉淀，直至洗出液無Cl—檢出，用磷酸氫二鈉緩沖液將胡敏酸沉淀溶解；
[0009]2)保外呼吸菌菌接種與擴繁培養(yǎng):在超凈工作臺下接種胞外呼吸細菌至LB液體培養(yǎng)基中，接種后避光搖床培養(yǎng)；
[0010]3)菌懸液離心:將培養(yǎng)好的菌懸液離心棄去上清液，保留菌體沉淀；
[0011]4)菌體重懸:往菌體沉淀中加入無機培養(yǎng)液，在漩渦振蕩器中將菌體重懸，得菌懸液；
[0012]5)粗胡敏酸組分的純化:將菌懸液加入步驟I提取出的粗胡敏酸溶液中，同時加入檸檬酸鐵和乳酸鈉溶液，隨后向混合液中充氮氣將瓶蓋密封，避光搖床震蕩培養(yǎng)得反應液；
[0013]6)具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸組分的提取與純化:將反應液過濾膜，收集濾液，用HCl調反應液的pH = 2，靜置后離心，棄上清液，用超純水沖洗胡敏酸沉淀至洗液無Cl—檢出后，用磷酸二氫鈉緩沖液溶解胡敏酸沉淀，得胡敏酸溶液；
[0014]7)胡敏酸穩(wěn)定還原能力的測定:往步驟6所得胡敏酸溶液加入步驟4中的菌懸液，同時加入檸檬酸鐵和乳酸鈉溶液。隨后往混合液中充氮氣將瓶蓋密封，避光搖床震蕩培養(yǎng)，得反應混合液，取部分反應混合液采用鄰菲啰啉法測定混合液中Fe2+的含量，根據加入的Fe3+量與反應后生成的Fe 2+量計算具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸的還原能力。
[0015]所述的還原能力測定方法，其中，步驟7之后進行胡敏酸穩(wěn)定還原能力的驗證:將步驟7中所得的反應混合液剩余部分過濾膜，重復步驟6和7，再測定胡敏酸的還原能力，并重復數次，若數次測定值相差小于10%，即證明所測的為胡敏酸的穩(wěn)定還原能力。
[0016]所述的還原能力測定方法，其中，步驟I中的NaOH和Na4P2O/混合液含有0.1M的NaOH 和 0.1M 的 Na4P2O7。
[0017]所述的還原能力測定方法，其中，步驟I中的NaOH和Na4P2O7混合液是以固液比lg: 1ml加入有機廢棄物中。
[0018]所述的還原能力測定方法，其中，步驟I和步驟6中的HCl為6M的HCl。
[0019]所述的還原能力測定方法，其中，步驟2中的LB液體培養(yǎng)基經過高溫滅菌處理。
[0020]所述的還原能力測定方法，其中，步驟4中的無機培養(yǎng)液的組成為1500mg/L的NH4Cl、600mg/L 的 NaH2PO4、100mg/L CaCl2、100mg/L 的 KCl、2mg/L 的 MgCl2、5mg/L 的 MnCl2、lmg/L NaMoO4，配置完后過0.22 μ m濾膜進行滅菌處理。
[0021]所述的還原能力測定方法，其中，步驟5中菌懸液加入粗胡敏酸溶液中的混合體積比為1:1。
[0022]所述的還原能力測定方法，其中，步驟5中檸檬酸鐵的濃度為ImM，乳酸鈉溶液的濃度為20mM。
[0023]所述的還原能力測定方法，其中，步驟7中反應混合液中Fe2+的含量測定方法如下:將反應混合液過0.22 μ m濾膜后，加入5ml鄰菲啰啉溶液，搖勻并用無菌水定容至25ml，靜置30min后，測定其510nm的吸光度值，并與FeSO4標準曲線對比，計算其中Fe 2+的含量。
[0024]本發(fā)明可以有效的將胡敏酸中不能穩(wěn)定進行電子轉移的組分降解去除，留下能穩(wěn)定進行電子轉移的部分，并測定胡敏酸中能穩(wěn)定進行還原能力的胡敏酸的還原能力。
[0025]本發(fā)明對于堆肥產品質量評價、堆肥技術優(yōu)化以及拓展堆肥產品應用均具有指導意義。
[0026]本發(fā)明操作便捷、篩選所得胡敏酸組分純度高、篩選效果好。
【附圖說明】
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[0027]圖1是有機廢棄物中具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸組分的提取及其還原能力測定流程圖。
[0028]圖2是廚余垃圾堆肥胡敏酸組分電子轉移能力變化圖；其中a為餐廚堆肥粗提胡敏酸組分電子轉移能力變化圖，b為餐廚堆肥穩(wěn)定電子轉移能力胡敏酸組分電子轉移能力
變化圖?！揪唧w實施方式】
[0029]本發(fā)明的有機廢棄物中具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸的還原能力測定方法中包括具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸的提取，主要步驟為:
[0030]I)有機廢棄物中粗胡敏酸組分的提取:將NaOH和Na4P2O/混合液以固液比lg: 1ml加入有機廢棄物中，室溫下避光震蕩16?24h，11000r/min離心1min后取上清液，隨即用6M的HCl將上清液酸化至pH = 2，靜置12h，11000r/min離心lOmin，棄上清液，用超純水沖洗胡敏酸沉淀，直至洗出液無cr檢出，用磷酸氫二鈉緩沖液將胡敏酸沉淀溶解。其中的NaOH和Na4P2O/混合液含有0.1M的NaOH和0.1M的Na 4P207。
[0031]2)MR-1菌接種與擴繁培養(yǎng):在超凈工作臺下接種胞外呼吸細菌MR-1至經過高溫滅菌處理的LB液體培養(yǎng)基中，接種后避光搖床培養(yǎng)12?24h。
[0032]3)菌懸液離心:將培養(yǎng)好的菌懸液12000r/min下離心lOmin，棄去上清液，保留菌體沉淀。
[0033]4)菌體重懸:往菌體沉淀中加入無機培養(yǎng)液，在漩渦振蕩器中將菌體重懸，得菌懸液。無機培養(yǎng)液的組成為 1500mg/L 的 NH4Cl、600mg/L 的 NaH2P04、100mg/L CaCl2UOOmg/L 的 KCl、2mg/L 的 MgCl2、5mg/L 的 MnCl2、lmg/L NaMoO4,配置完后過 0.22 μ m 濾膜進行滅菌處理。
[0034]5)粗胡敏酸組分的純化:將菌懸液加入步驟I提取出的粗胡敏酸溶液中，兩者混合的體積比為1:1，同時加入檸檬酸鐵和乳酸鈉溶液，檸檬酸鐵的濃度為ImM，乳酸鈉溶液的濃度為20mM。隨后往混合液中充氮氣15?30min，充氮結束后將蓋上蓋子并采用封口膜將瓶蓋密封，避光搖床震蕩培養(yǎng)24h，得反應液。
[0035]6)具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸組分的提取與純化:將反應液過0.45 μ m濾膜，收集濾液，用6M的HCl將反應液pH調至pH = 2，靜置12h后，12000r/min離心lOmin，棄上清液，用超純水沖洗胡敏酸沉淀直至洗液不再有Cl—檢出后，用磷酸二氫鈉緩沖液溶解胡敏酸沉淀，得胡敏酸溶液。
[0036]7)胡敏酸穩(wěn)定還原能力的測定:往步驟6所得胡敏酸溶液加入步驟4中的菌懸液，同時加入檸檬酸鐵和乳酸鈉溶液。隨后往混合液中充氮氣15?30min，充氮結束后立即封蓋并用封口膜將瓶蓋密封，避光搖床震蕩培養(yǎng)12h，得反應混合液，取反應混合液中的一部分，采用鄰菲啰啉法測定混合液中Fe2+的含量，根據加入的Fe 3+量與反應后生成的Fe 2+量計算具有穩(wěn)定還原能力胡敏酸的還原能力。
[0037]反應混合液中Fe2+的含量測定方法如下:將反應混合液過0.22 μ m濾膜后，加入5ml鄰菲啰啉溶液，搖勻并用無菌水定容至25ml，靜置30min后，測定其510nm的吸光度值，并與FeS04#準曲線對比，計算其中Fe 2+的含量。
[0038]8)胡敏酸穩(wěn)定還原能力的驗