一種定量分析微量血干血濾紙片上視黃醇及其前體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微量血干血濾紙片中視黃醇及其前體的分析檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血液中視黃醇均需從動(dòng)植物食品中攝入，由其前體物質(zhì)：β -胡蘿卜素、視黃醇乙 酸酯和視黃醇棕櫚酰酯在腸粘膜和肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)化形成，共同存在于血液中。只有綜合視黃 醇及其前體的含量信息才能全面衡量體內(nèi)視黃醇的水平。
[0003] 目前，普遍采用用焚光、紫外線分光光度法和高效液相色譜儀（High performance liquid chromatography，HPLC)定量分析血清或血衆(zhòng)中視黃醇，前兩種方法萃取步驟繁瑣， 結(jié)果受雜質(zhì)影響大；而HPLC法可對(duì)血清中復(fù)雜組分進(jìn)行分離，其檢測敏感性與特異性相對(duì) 較高，但多數(shù)僅開發(fā)了檢測視黃醇的方法，少有分析其多種前體的方法。
[0004] 此外，以上技術(shù)所需靜脈血量均較大，約l_2ml，對(duì)于人群則必須抽取靜脈血，對(duì)于 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也須取靜脈血，有的甚至需處死后取血，無論對(duì)于人群，還是對(duì)于動(dòng)物，其依從性 均較差，且標(biāo)本不便于遠(yuǎn)距離運(yùn)送，這為分析人群和動(dòng)物模型視黃醇及其前體水平，研宄其 生理病理功能帶來較大困難。Whatman 903'?!紙片能穩(wěn)定、均一、定量吸附血液，是一款通 過美國FDA驗(yàn)證通過的體外二級(jí)診斷用產(chǎn)品。通過采集微量血，吸附于Whatman 903~濾紙 片上，形成干血濾紙片，以便于標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸，也可彌補(bǔ)基層或部分缺乏高端檢 測儀器及其操作人員的不足而不能分析視黃醇水平，同時(shí)已證實(shí)視黃醇可穩(wěn)定存在干血濾 紙片中。因此，采集微量血制成干血濾紙片是廣泛分析人群和動(dòng)物模型視黃醇水平的理想 標(biāo)本。然而，這種標(biāo)本血液標(biāo)本甚少（約10 μ L)，且在其中的含量甚微，而傳統(tǒng)HPLC的靈敏 度相對(duì)低，不能分析。目前國際、國內(nèi)仍缺乏分析利用干血濾紙片定量分析視黃醇及其前體 的方法。
[0005] 串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS)儀具有高選擇性、高靈敏度的優(yōu) 勢，是近年來飛速發(fā)展的技術(shù)，與HPLC對(duì)復(fù)雜樣品的高分離濃縮、高通量能力的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合 起來，對(duì)微量生物樣品多組分同步分析具有突出優(yōu)勢，為解決這一技術(shù)難題提供了可能。但 文獻(xiàn)中對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜中分析視黃醇及其前體的各項(xiàng)參數(shù)報(bào)道較少，且儀器廠家、型號(hào)的差異， 導(dǎo)致沒有現(xiàn)成的檢測參數(shù)可以采用，必須根據(jù)本研宄單位自己優(yōu)化確定。此外，HPLC對(duì)視 黃醇及其前體的分離方法的報(bào)道也較少，且分析時(shí)間較長，約30min，不利于大樣本分析。同 時(shí)，提取干血濾紙片視黃醇及其前體的方法尤為重要，是能有效檢測的前提，它將影響整個(gè) 方法的靈敏度。但目前國際、國內(nèi)仍缺乏分析從干血濾紙片中提取視黃醇及其前體的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種定量分析微量血干血濾紙片中視黃醇及其前體的方 法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種檢測視黃醇及其前體的方法，包括以下步驟：
[0009] (1)從樣品中萃取視黃醇和/或其前體；
[0010] (2) HPLC分離視黃醇和/或其前體；
[0011] (3)MS/MS 定量檢測；
[0012] 所述樣品是干血濾紙片標(biāo)本，采用的萃取劑為三氯甲烷。
[0013] 上述萃取步驟包括蛋白變性步驟，采用試劑為含有0. 1 % BHT和0. 025mmol/L KOH 的甲醇。
[0014] 上述從樣品中萃取視黃醇和/或其前體包括以下步驟：
[0015] ①血片溶解：將載有微量血的干血濾紙片用打孔器打出直徑3. 2mm(即3. 2 μ 1的 全血）圓形濾紙血片，置于I. 5ml EP管中，加入100 μ 1含0. 1% BHT作為抗氧化劑的去離 子水，室溫振搖，lOOOrpm，2min，充分溶解血液；
[0016] ②蛋白變性：取步驟①所得血斑標(biāo)本，加入200 μ 1含有0. 1% BHT和0. 025mmol/ L KOH的甲醇變性沉淀蛋白質(zhì)，漩渦震蕩2min ;
[0017] ③萃取：以300 μ 1三氯甲烷作為萃取劑，取步驟②所得的所有溶液，在其中加入 萃取劑，室溫振搖2min，離心13200rpm，8min ;
[0018] ④小心吸取含視黃醇、視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酰酯、β -胡蘿卜素的有機(jī)溶劑 層（底層）180 μ 1，氮?dú)獯蹈?。加?00 μ 1流動(dòng)相充分溶解。HPLC-MS/MS上機(jī)檢測。
[0019] 上述HPLC分離視黃醇和/或其前體步驟中，采用C8色譜柱，甲醇：CH2CL 2 = 95 : 5(v/v)為流動(dòng)相，以0. 2ml/L等度流速，保持柱溫20°C進(jìn)行液相分離。
[0020] 上述MS/MS定量檢測步驟中，以APCI離子源作為離子源，MRM質(zhì)譜檢測參數(shù)采用 表1所示。
[0021] 表1 MS/MS定量檢測優(yōu)化參數(shù)
[0022]
[0023] 上述MS/MS定量檢測步驟中，MRM質(zhì)譜檢測參數(shù)的篩選包括以下步驟：
[0024] I.多反應(yīng)檢測模式（Multiple reaction model，MRM)離子對(duì)選擇
[0025] 鑒定準(zhǔn)分子離子：通過Analyst軟件，開啟裝有化合物的針泵Syringe Pump (10 μ L/min)，注入單一標(biāo)準(zhǔn)品工作液（5 μ g/ml)，選擇Ql Scan，Positive (正離子） 掃描，根據(jù)視黃醇及其前體分子量，輸入質(zhì)量掃描范圍：視黃醇m/z 200-300,視黃醇乙酸 酯m/z 200-400,視黃醇棕櫚酰酯m/z 250-550, β-胡蘿卜素 m/z 200-550, d6-視黃醇棕 櫚酰酯m/z 250-350,掃描時(shí)間2min，鑒定準(zhǔn)分子離子，即母離子Ql的質(zhì)荷比參數(shù)；
[0026] 觀察到所有樣品待測離子都出現(xiàn)在Ql Scan中，檢查Ql信號(hào)的穩(wěn)定性，以便于質(zhì) 譜參數(shù)的優(yōu)化。Q3掃描，即產(chǎn)物離子掃描模式確定離子強(qiáng)度最高的2-3個(gè)碎片離子Q3。
[0027] II. MRM質(zhì)譜檢測參數(shù)的優(yōu)化
[0028] 監(jiān)測化合物信號(hào)的穩(wěn)定性以后，采用Ql SM掃描，輸入準(zhǔn)分子離子m/z，對(duì)其DP、 EP和CEP進(jìn)行優(yōu)化；具體方法是在Ramp Parameter Settings窗口下選擇DP，點(diǎn)擊Start 得到一個(gè)離子的電壓曲線圖，以DP值作為X軸，信號(hào)強(qiáng)度作為Y軸，取信號(hào)強(qiáng)度最高時(shí)對(duì)應(yīng) 的DP作為其的優(yōu)化值，記錄每一個(gè)離子優(yōu)化的DP值，回到Edit Ramp，重復(fù)此過程對(duì)EP和 CEP進(jìn)行優(yōu)化；
[0029] 用確定的Q1/Q3離子對(duì)來優(yōu)化CE和CXP :選擇MRM模式，輸入觀察到的Q1/Q3離子 對(duì)m/z，用優(yōu)化的DP、EP和CEP的值，點(diǎn)擊Edit Ramp鈕，選擇Collision Energy設(shè)定起始 值及終止值和步距：按Start或Acquire開始掃描，形成以CE值作為X軸，信號(hào)強(qiáng)度作為Y 軸，取信號(hào)強(qiáng)度最高時(shí)對(duì)應(yīng)的CE作為這一碎片離子的CE優(yōu)化值；先優(yōu)化CE再重復(fù)此過程 優(yōu)化CXP ;
[0030] 換用陰離子模式，比較陰、陽離子模式各化合物的離子強(qiáng)度，取強(qiáng)者為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使 用的模式。
[0031] 本發(fā)明中，通過MultiQuant 2. 0. 2軟件，以峰面積積分法對(duì)MS/MS定量檢測數(shù)據(jù) 進(jìn)行分析，計(jì)算峰面積，完成HPLC-MS/MS定量檢測數(shù)據(jù)的收集；以d6-視黃醇棕櫚酰酯為內(nèi) 標(biāo)，以普通標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，以二者濃度比為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建 HPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)定量分析方法。
[0032] 有益效果
[0033] 1.本發(fā)明利用濾紙片（如Whatman 903?紙）作為載體吸附微量血，制成干血濾 紙片，克服了以往收集血清檢測視黃醇時(shí)靜脈血采集時(shí)取血多，人群依從性差，動(dòng)物模型抽 血死亡，標(biāo)本不方便遠(yuǎn)距離運(yùn)送等困難。
[0034] 2.本發(fā)明將視黃醇及其各前體的特異分析與HPLC-MS/MS技術(shù)優(yōu)化結(jié)合，提供了 分析視黃醇及其前體（β-胡蘿卜素、視黃醇乙酸酯和視黃醇棕櫚酰酯）質(zhì)譜分析中分子離 子峰、碎片離子峰、解簇電壓、碰撞能量、碰撞室入口電壓和出口電壓等參數(shù)，獲得最佳MS/ MS分析條件；在色譜分析中，優(yōu)化了固定相、流動(dòng)相、柱溫等色譜分離條件；計(jì)算所獲得的 各物質(zhì)峰面積確定了最適萃取方法，首次建立了從濾紙片上提取視黃醇及其前體（β -胡 蘿卜素、視黃醇乙酸酯和視黃醇棕櫚酰酯）的方法。
[0035] 3.本發(fā)明克服了現(xiàn)有分析方法靈敏度低，不能分析微量血視黃醇及其前體的困 難；本發(fā)明基質(zhì)效應(yīng)小、在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的濃度范圍內(nèi)分析的線性關(guān)系良好、檢出限較低、靈 敏度高、準(zhǔn)確性好、精密度高，與HPLC方法檢測血清視黃醇結(jié)果具有相關(guān)性，并同時(shí)同步分 析樣品中視黃醇及其前體含量，為全面評(píng)估體內(nèi)視黃醇水平提供了方法。
【附圖說明】
[0036] 圖1不同色譜柱分離色譜圖；A-C8色譜柱分離色譜圖，B-C18色譜柱采樣圖
[0037] 圖2不同流動(dòng)相下視黃醇及其前體的色譜圖（Α :純乙腈作為流動(dòng)相所獲色譜圖； B :純甲醇作為流動(dòng)相所獲色譜圖；C :甲醇：二氯甲烷=95 : 5作為流動(dòng)相所獲色譜圖；D : 甲醇：二氯甲烷=90 : 10作為流動(dòng)相所獲色譜圖；E :